[发明专利]海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法

说明书

技术领域：

本发明属于海洋养殖废水处理技术领域，尤其是涉及工厂化高密度养殖废水的生物脱氮的方法。

背景技术：

海洋水产养殖业是缓解人类对食物的需求压力，避免对海洋生物资源过度捕捞的重要手段。中国的水产养殖业已经进入持续高速发展阶段，养殖方式高度集约化使养殖业自身污染问题逐渐显露且日渐突出，造成养殖环境恶化，病害流行，而为了控制疾病盲目使用抗生素给整个水产养殖业造成了巨大的经济损失。循环水高密度工厂化养殖占用的资源少，全年都可以生产商品化的水产品，对环境友好，是水产养殖业发展的方向。高密度工厂化养殖主要对养殖水环境有较高的要求，必须快速的去除残饵、粪便等有机物，同时将快速产生的氨氮、亚硝态氮保持在较低的水平。

目前养殖废水脱氮的方法很多，其中生物脱氮技术具有投资和运转费用较低，且无二次污染等优点，是较为经济有效的方法。生物脱氮主要通过三种方式来完成，一是利用绿色植物的光合作用同化养殖废水中的含氮化合物，实现养殖水的循环和处理，其最大的缺点是效率低，占地面积大。二是利用自养的硝化菌和厌氧的反硝化菌将氨氮转化成亚硝态氮、硝态氮，最后转化为氮气完成生物脱氮的全过程，该方法是目前高密度工厂化养殖废水处理的主要方法，其不利之处在于完成硝化作用的自养细菌属于化能自养细菌，比生长速率较低、养殖水体酸化、在没有反硝化单元的处理系统中往往造成硝态氮的积累，对养殖的生物和环境产生不利的影响，同时反硝化要求厌氧的环境，养殖水体是富氧的环境，在实际运行中难度较大。生物脱氮的第三种方法是异养硝化，直接利用细菌的同化作用转化、吸收水体中的含氮物质，工艺简单、转化的效率高，但是异养硝化细菌的分离筛选困难，硝化过程产生的生物量大。CN03118598.3叙述了在土壤中分离异养硝化细菌的方法，中国专利申请200510030456.3和200610010263.6中也阐述了异养硝化细菌的筛选方法，三种方法的不利之处在于直接从自然环境中分离筛选，微生物种类多，工作量较大。利用异养硝化细菌进行养殖废水脱氮的最大好处是在处理系统中没有亚硝态氮和硝态氮的积累，同时去除有机物，是较有应用前景的生物脱氮方式。

影响海洋异养脱氮细菌生长和发挥作用的因素主要包括pH、碱度、温度、DO、氨氮、盐度、硝化细菌的数量和存在方式，在混养富集和分离的各个阶段要创造哈应异养脱氮细菌的良好条件。

发明内容：

本发明的目的获得异养硝化细菌和异养硝化好氧反硝化细菌，其最终目的是转化工厂化养殖废水中的无机氮化合物，从而实现养殖废水的循环，既减少环境对养殖生物的危害，又减少养殖废水排放对环境的危害。本发明采用自养阶段逐步提高氨氮浓度的方法富集、驯化海洋异养脱氮细菌，异养阶段增加海洋异养脱氮细菌的数量，并通过分子生物学的方法筛选具有脱氮基因的菌株，最后用氮平衡试验最终验证菌株的氮代谢特性。该方法可以建立异养脱氮细菌为主体得微生物菌群，从而有利于异养脱氮生物反应器的建立。该方法不但对海洋养殖废水进行生物脱氮，并且对COD也有一定的去除效果。本发明的方法是通过以下步骤实现的：

1、海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于其按如下步骤进行：

(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.2-20mg/L。经过30-50天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到8-20mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。

(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在8-20mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的COD_Mn在10-400mg/L。异养养富集驯化持续5-20天结束。

(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，23-30℃培养2-5天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。