[发明专利]海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法

权利要求书

1.海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，其特征在于其按如下步骤进行：

(一)、海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的自养富集驯化在一定体积的容器内进行，向容器内加入一定体积海洋养殖废水，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度在0.2-20mg/L。经过30-50天的富集驯化，氨氮的添加浓度达到8-20mg/L左右，自养富集驯化阶段结束。

(二)、海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化阶段：海洋异养脱氮细菌的异养富集驯化在一定的体积的容器内自养富集驯化结束后进行，控制水体的溶解氧在3mg/L以上，用Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，调节盐度在2.5％-3.5％，控制水体温度在28±1℃，每天继续流加无机氨氮，使富集驯化液的氨氮浓度保持在8-20mg/L，每天添加一定量鱼饵的浸出液，使异养阶段的COD_Mn在10-400mg/L。异养养富集驯化持续5-20天结束。

(三)、海洋异养细菌的分离：海洋异养细菌的分离采用海水配制的固体有机培养基，将混养富集驯化液经系列稀释涂布于固体有机培养基上，23-30℃培养2-5天，对培养基上生长的菌落特征不同的菌落进行划线纯化后获得纯菌株转斜面保存。

(四)海洋异养脱氮细菌的基因检测：利用特异性引物对氨单加氧酶(AMO)基因(amoA)和周质硝酸盐还原酶(NAR)亚基基因(napA)进行DNA扩增，电泳分离扩增产物，快速筛选具有潜在氨氧化能力和能进行硝酸盐还原的菌株。

(五)海洋异养脱氮菌株的氮平衡分析：在自养型培养基中接种具有amoA或napA基因的菌株，在28±1℃，150-200rmp转速下培养细菌24-48小时，检测培养前后的氨氮、亚硝态氮、硝态氮和有机氮，经过氮素的定量计算，和不加菌的对照相比，确定异养脱氮菌株的氮代谢特性，获得异养硝化细菌或异养硝化好氧反硝化菌株。

2.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，自养富集驯化其特征在于所说的海洋异养脱氮细菌的富集驯化方法为：在一定体积的容器内加入养殖废水，循环水曝气保证溶解氧在3mg/L以上，用1M的Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，用淡水调节盐度在1.020左右，控制水体温度在28±1℃，每天氨氮，使富集驯化液氨氮浓度在0.2-20mg/L的氯化铵溶液来进行自养富集驯化，将氨氮浓度调整到较低的浓度，但不低于0.2mg/L，在自养富集驯化结束时，每天添加的氨氮使富集驯化液不超过20mg/L。经过30-50d以上的驯化，自养富集驯化阶段结束。

3.根据权利要求1所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，异养富集驯化的特征在于自养富集结束后进行异养富集驯化，循环水曝气保证溶解氧在3mg/L以上，用1M的Na₂CO₃溶液调节pH在7.5-8.5之间，用淡水调节盐度在1.020左右，控制水体温度在28±1℃，保持自养富集驯化结束时的氨氮浓度8-20mg/L，同时添加高蛋白的有机液体，使富集驯化液的COD_Mn在10-400mg/L，并保持5天以上，但不超过20天。

4.根据权利要求1或2所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，自养富集驯化的特征在于(1)首次添加氨氮的浓度在0.2-2mg/L之间；(2)提高氨氮浓度的时机在于氨氮浓度开始降低；(3)自养富集驯化持续的时间在30-50天。

5.根据权利要求1或3所述海洋异养脱氮细菌的混养筛选方法，异养富集驯化的特征在于(1)保持自养富集驯化结束时的流加氨氮浓度在8-10mg/L；(2)添加高蛋白的有机液体，使富集驯化液COD_Mn在10-400g/L；(3)异养富集驯化持续的时间在5-20天。