[发明专利]猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及两种不含抗性标记的分别表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因-COE基因和SD基因的重组的猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonellu)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性，最常见的沙门氏菌属有鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。沙门氏菌对人和动物均有较强的致病力，可引起人体和动物的胃肠道疾病，沙门氏菌在外界环境中的生存能力较强，在利用基因工程的方法致弱以后，仍具有较强的侵袭力。

最初预防沙门氏菌的疫苗是全菌灭活苗，但该疫苗只能激发机体的体液免疫，且易引起副作用，另外，还存在着需免疫多次和无交叉保护的缺点，因而不能广泛应用。此后，研究学者模拟沙门氏菌肠道自然感染的方式，给动物口服减毒的沙门氏菌(如肠炎沙门氏菌Ty21a的口服弱毒苗)，结果发现，可诱导机体产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此受到很多研究学者的普遍重视(Gernianier R et al.，1975)。

由于肠炎伤寒沙门氏菌Ty21a致弱的遗传背景不清晰，各国研究学者，尝试运用基因工程的方法，研究遗传背景清晰的伤寒弱毒基因缺失疫苗株，用于口服免疫研究，例如，aro基因缺失株(Dougan G et al.，1988)、cya/crp缺失株(Alper M D et al.，1978)、Dam和phoP/phoQ缺失株(Galan J E et al.，1989)、asd基因缺失株(徐引弟等，2006)等。

弱毒沙门氏菌除本身可以作为疫苗以外，也可被用作载体来表达外源抗原基因，近年来，以弱毒沙门氏菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌和寄生虫等的外源抗原，研制多价基因工程疫苗成为该领域的研究热点，从而为研制新型基因工程疫苗开辟了新的途径(Zhao Z et al.，2008)。

近年来，弱毒沙门氏菌为载体的基因工程疫苗成为研究的热点，其优越性主要表现在(徐引弟博士论文，2006)：

(1)抗原递呈的有效性，尤其是口服或滴鼻免疫时，效果更佳(Dietrich et al.，1998)；

(2)可产生特异性细胞毒性T细胞杀伤反应(CTL效应)；

(3)可以激发黏膜和系统免疫反应。以弱毒沙门氏菌为载体的疫苗经口服或滴鼻的方式免疫后，可以直接将外源抗原运载至机体的黏膜相关淋巴组织(MALT)，从而激发机体的黏膜和系统免疫反应(Spreng et al.，2006)；

(4)具有免疫佐剂作用。沙门氏菌的LPS是一种内在佐剂，此外，有研究表明，沙门氏菌内部有一个非甲基化的CpG DNA序列，具有较强的免疫刺激活性，可以促进机体内部Th型为主的免疫应答，因而，被认为是具有应用潜力的免疫增强剂和免疫佐剂(Paglia et al.，1998)；

(5)免疫具有持续性。减毒沙门氏菌载体所携带的质粒不易丢失，且可长期稳定地存在于机体淋巴组织内，从而不需反复多次地加强免疫也可长期地激发机体的免疫应答反应；

(6)联合免疫作用。减毒沙门氏菌本身所携带的抗原与质粒表达的外源抗原起到了联合免疫的作用，同时，还可以将2个或2个以上的外源抗原基因插入到表达质粒中，免疫宿主后可针对不同的外源抗原产生相应的免疫反应，从而达到一次免疫防治多种疾病的疗效；

(7)所表达的抗原蛋白不需提纯。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗，只需过夜培养即可直接免疫，从而省去了诱导剂诱导与纯化蛋白的步骤，制备过程简单、省时，且易于储存运输，因此，可显著降低疫苗制作成本；

(8)接种方式简便，易于操作，适于群体免疫，且安全性好。

猪霍乱沙门氏菌C500弱毒株是在含醋酸铊的培养基中，连续传代500次致弱的菌株，其具有良好免疫原性，实践也证明了C500株具有良好的免疫原性，且能激活全身、局部和粘膜免疫系统，具有副作用低、安全性好的特点。其中，最常用的是沙门氏菌Asd-平衡致死系统(Galan J E，et al.1990)。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟博士构建了C500株的asd基因缺失株Δasd C500，经实验证实Δasd C500缺失株的免疫原性，与C500菌株相比，毒力更低，安全性更好(徐引弟等，2006)，且已应用于重组活疫苗的制备，如申请人所在农业微生物国家重点实验室构建了猪传染性胃肠炎的重组沙门氏菌活疫苗，经临床验证，该疫苗具有较好的免疫预防效果，且已申请了中国发明专利(专利申请号为2009100639279)。