[发明专利]猪流行性腹泻病毒重组猪霍乱沙门氏菌基因工程活疫苗及制备与应用

权利要求书

1.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，其特征在于，所述的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C501-COE和C501-SD保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297，所述的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD分别含有表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因COE和SD，它们的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2和4所示。

2.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD的制备方法，它包括下列步骤：

1)分别构建重组质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD，用如下所示的两个引物对从患猪流行性腹泻病(Porcine epidemic diarrhea)的病猪粪便病料中分别扩增猪流行性腹泻病毒COE基因和SD基因，所述的COE基因和SD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示：

所用引物对的DNA序列分别如下所示：

COE正向引物：GATGAATTCATGCATGAACAGCCAATTTC(5′→3′)，

COE反向引物：GGGAAGCTTGATAGTATACTTGGTACACACATCC(5′→3′)；

SD正向引物：GACGAATTCATGACAGACGTTTCTTTTATGACTC(5′→3′)，

SD反向引物：GGGGTCGACAATACTCATACTAAAGTTGGTGGG(5′→3′)；

分别将其亚克隆至原核表达载体pET-32a上，构建重组质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD，其中重组质粒pET-32a-COE包含如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述的重组质粒pET-32a-SD包含如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

2)分别构建重组质粒pYA-COE和pYA-SD，将构建正确的原核表达质粒pET-32a-COE和pET-32a-SD分别进行双酶切，并与经过相同双酶切的穿梭质粒pYA3493进行连接，转化asd基因缺失的大肠杆菌x6097，筛选阳性克隆；

3)分别构建重组猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD，将重组质粒pYA-COE和pYA-SD电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株中，分别得到保藏编号为CCTCC NO：M2011296和CCTCC NO：M2011297的猪霍乱沙门氏菌C501-COE和C501-SD。