[发明专利]猪肺炎支原体间接ELISA抗体检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65，其特征在于，所述的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号分别为CCTCC NO：M2011294和CCTCC NO：M2011295，所述的大肠杆菌分别表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白p46和p65，其编码的蛋白质的序列分别如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。

2.一种重组的大肠杆菌pGEX-KG-46和pGEX-KG-65的制备方法，它包括下列步骤：

1)分别构建重组质粒pGEX-46和pGEX-65，用如下所示的两个引物对分别扩增猪肺炎支原体膜蛋白p46和p65的基因片断，所述的p46和p65的基因片断的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示；

所用引物对的DNA序列分别如下所示：

p46正向引物：CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA(5′→3′)，

p46反向引物：CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA(5′→3′)；

p65正向引物：AAAGGATCCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

p65反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)；

分别将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG上，构建重组质粒pGEX-46和pGEX-65，其中重组质粒pGEX-46包含如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；重组质粒pGEX-65包含如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

2)利用三个引物对将猪肺炎支原体的p46蛋白基因片断中210bp、303bp和662bp处的碱基A人工定点突变为碱基G，所用引物对的DNA序列如下所示：

其中：

扩增SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的210bp处碱基突变的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：AATCCTCGATGGATTAGTGCC(5′→3′)，

反向引物：CCATCGAGGATTATCCGGAT(5′→3′)；

扩增SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的303bp处碱基突变的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5′→3′)，

反向引物：CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5′→3′)；

扩增SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的662bp处碱基突变的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5′→3′)，

反向引物：CCATCCTGGGACATAAACAGC(5′→3′)；

利用一个引物对将猪肺炎支原体的p65蛋白基因片断中633bp处的碱基A人工定点突变为碱基G，所用引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5′→3′)，

反向引物：CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5′→3′)。