[发明专利]高效液相色谱分析方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及甾体药物的微生物合成领域，具体而言，涉及一种高效液相色谱分析方法及其在植物甾醇微生物转化生产雄烯二酮中的应用。

背景技术

近年来甾体药物生产持续增长，而传统的甾体药物生产主要是从野生中药材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂苷元后经化学合成而成，其工艺十分复杂，所用原料紧缺，成本很高，而且污染环境，因此，以植物甾醇为原料合成甾体药物的加工业迅速兴起，并以惊人的速度发展起来。目前植物甾醇已成为甾体药物合成的主要原料。这从根本上改变传统化学合成甾体药物步骤多、得率低、价格贵等方面的不足，还充分利用资源优势，摆脱原材料来源因季节、地域等自然因素对生产的制约，有利于保护自然资源和生态。

雄烯二酮(AD)是许多甾体药物合成的关键中间体，是生产甾体类激素药物的重要原材料之一。作为前体，它可以继续合成诸类皮质激素、雌激素、雄激素、蛋白同化激素等20多种甾体类激素药物。目前生产雄烯二酮的方法是利用特定的微生物菌株，在水/有机溶剂两相发酵系统中，将植物甾醇的侧链选择性切除，从而转化成雄烯二酮。雄烯二酮的结构式为：

在利用微生物转化法生产雄烯二酮的过程中，所使用的原料是从植物油精练下脚，脱臭馏出物中提取出来的植物甾醇，它是菜籽甾醇(Brassicasterol)、菜油甾醇(Campesterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)的混合物，这4种单体甾醇的结构非常相似，只在个别基团上存在差异，各自的结构式如下：

菜油甾醇       β-谷甾醇

Campesterol    β-Sitosterol

豆甾醇         菜籽甾醇

Stigmasterol   Brassicasterol

这种结构上的大致相似性给后续的检测工艺带来了一定困难，利用传统的检测方法很难将其分开，从而无法得知微生物在发酵过程中尤其嗜好哪一种植物甾醇，给以后的原料选择带来不便。同时在发酵过程中，不仅合成了雄烯二酮，而且有许多副产物生成，这些副产物的产生可能会影响雄烯二酮的准确测定，给企业的生产带来不便。因此，有必要寻求一种或几种方法，以便可以准确测定植物甾醇以及雄烯二酮。

目前现有技术中测定植物甾醇的方法有：

1.传统方法重量法，即采用洋地黄皂甙在一定条件下与甾醇反应，生成沉淀经烘干称量而测得甾醇含量。此方法操作步骤多、分析时间长、干扰因素较多；

2.TLC薄层层析法，而用TLC薄层层析板只能进行粗略的估计，由于植物甾醇的微生物转化产物结构接近，使用薄层色谱方法灵敏度低，不符合生产指标的先进性；

3.高效液相色谱法检测法，采用UV检测器，并以甲醇作为流动相，检测波长为205nm(吸收波长)，其波长短干扰大，易受流动相、样品处理方法的影响，给分析带来一定的困难，而且样品测定时间较长，选择性相对较差，难以对结构相似产物进行检测；

4.气相色谱法，样品需要脂化30分钟、还需进行萃取、蒸干等操作步骤，处理方法时间长，干扰因素多。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高效液相色谱分析方法及其应用。

具体而言，本发明提供：

(1)一种高效液相色谱分析方法，所述分析方法包括：对含有甾体类化合物的混合物用高效液相色谱法进行成分分析；

其中，所述高效液相色谱法采用反相高效液相色谱，并且采用梯度洗脱，其中所述梯度洗脱的流动相分别为水和95％乙腈。

(2)根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述甾体类化合物包括：雄烯二酮和/或植物甾醇；优选地，所述植物甾醇包含菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和/或β-谷甾醇。

(3)根据(1)所述的分析方法，其中，所述高效液相色谱法采用的检测器为二极管阵列检测器(DAD)。

(4)根据(3)所述的分析方法，其中，所述高效液相色谱法采用的检测波长为210nm。

(5)根据(1)所述的分析方法，其中，所述梯度洗脱的条件按时间分段设定为：

0至6分钟，水为10-15体积份、95％乙腈为90-85体积份；

大于6分钟至30分钟，水为0体积份、95％乙腈为100体积份；

大于30分钟至35分钟，水为10-15体积份、95％乙腈为90-85体积份。

(6)根据(5)所述的分析方法，其中，所述梯度洗脱的时间与流速的程序如下表所示：