[发明专利]基因突变和HIV-1耐药突变位点检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及PCR技术、反向杂交技术和单核苷酸延伸标记技术。

背景技术

据中国卫生部统计结果，截至2010年，全国累计报告人获得性免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染者和艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)病人约75万例，全国每年有大量的艾滋病感染者接受免费高效联合抗逆转录病毒(HighlyActive Antiretroviral Therapy，HAART)治疗，HAART治疗能够有效控制病毒复制，延长患者的生命，大大地降低HIV/AIDS相关疾病的发病率和病死率。但是HIV耐药性的出现却极大地限制了抗病毒治疗的效果。选择一个能最大限度地抑制HIV-1复制的药物治疗方案已成为一个极具挑战性的任务。因此，了解HIV感染者病毒耐药变异情况，有针对性的选择抗病毒药物组合，成为艾滋病治疗工作中的一个重要内容。

HIV-1逆转录酶的不忠实性复制会造成错误碱基的掺入，同时逆转录酶不具备校正功能，所以在病毒复制过程中会产生大量变异。据文献报道，每天艾滋病人体内会产生大约10⁷～10⁸子代病毒，逆转录酶的错配几率约为3.4×10⁵/碱基。HIV基因全长约10kb，因此每天会产生10⁴～10⁵个单点突变。在数量众多的突变中，对抗病毒药物具有抵抗作用的基因突变株在药物选择压力下逐渐成为优势病毒株，会导致病毒学治疗失败，进而发展成免疫学失败，最终导致临床失败。研究证明，根据耐药检测结果选择抗病毒治疗方案可有效地降低病毒载量，升高CD4细胞含量，从而极大地改善HIV-1感染者抗病毒治疗的效果。1999年耐药性协作研究组(Resistance Collaborative Group，RCG)的一项用药方案与病毒耐药基因型表型之间关系的研究结果表明，有针对性的对基因型或表型预测失败者更改用药方案可以使治疗失败率降低30％～50％。因而在抗病毒治疗的过程中对每一个患者进行耐药突变检测是提高治疗效果、延长病人生命、降低发病率和病死率的重要手段。

目前HIV耐药检测方法主要有3种：基因型耐药检测(GART)、表型耐药检测(PART)和虚拟耐药检测(virtual phenotype，vPT)。传统的基因型耐药检测以核酸序列测定为基础，首先通过RT-PCR扩增出HIV的蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列，然后与参比毒株的核酸序列比较了解耐药位点是否发生变异。以RT-PCR扩增产物测序为基础的检测方法准确性高、信息全面，是HIV耐药临床检测金标准。但是测序方法存在如下缺点：检测灵敏度不高，一般要求检测样本病毒拷贝数＞1000cp/ml；分辨率低，不能检出相对含量小于20％的病毒突变株；不能直接提供耐药信息，且无法定量；由于耐药位点变异多且较为分散，需要同时进行多个测试反应。HIV耐药位点表型检测首先需要对HIV感染者进行病毒分离培养，然后再进行药物敏感实验。近年来出现了利用重组病毒进行HIV-1表型耐药检测。该方法主要是将HIV感染者体内的病毒蛋白酶和逆转录酶基因插入载体，同时与骨架质粒共转染细胞包装重组病毒，应用重组病毒进行耐药表型检测。表型检测具有如下优点：可以对病毒耐药情况进行定量分析；对B亚型和非B亚型均可进行分析；可以检测病毒序列中所有突变的作用，结果易于解释。但是表型检测由于受到价格昂贵、周期长、生物安全级别要求高等缺点很难大范围推广使用。虚拟表型检测首先需要建立基因型和表型之间的对应的数据库，通过对比测序结果，在数据库找出与感染者体内病毒序列相同或相似的序列，即可以给出药物敏感的参考意见。虚拟表型分析的可靠性依赖于数据库资料的准确性，要求随时更新耐药位点与表型之间的对应关系。但是虚拟表型检测仍然需要进行序列测定，同样受到基因型检测适用范围的限制。许多研究表明，各种表型耐药检测和基因型耐药检测的结果具有较高的一致性，并提出用基因型代替表型耐药检测。

无论是表型检测还是基因型检测目前只能在有条件的实验室中小范围使用，因此研发一种实验周期短，准确性好，灵敏度高，同时能够进行多位点检测，价格便宜，能够在基层医疗单位使用的耐药检测试剂在艾滋病防治工作中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以同时检测多个基因突变的方法和一种HIV-1耐药突变位点基因检测试剂盒。此方法整合了基因扩增、反向杂交和单核苷酸延伸标记技术。