[发明专利]基因突变和HIV-1耐药突变位点检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种能够检测单核苷酸突变的方法，其特征包括：

1)通过PCR扩增含有单核苷酸突变位点的基因片段；

2)杂交探针探针与扩增片段互补，探针3’端最后一个碱基位于突变位点的前一个碱基，所有探针退火温度控制在42至45摄氏度；

3)杂交探针固定在杂交膜的特定位置；

4)杂交探针能够作为引物在DNA聚合酶的作用下延伸；

5)探针延伸到碱基即为检测的突变位点；

6)杂交膜分为4个独立的反应区间，每个反应区间分别加入不同的标记的dNTP或ddNTP；

7)延伸反应在杂交膜上进行；

8)用四种不同标记物分别标记dATP、dCTP、dGTP、dUTP时，延伸反应也可以在同一个杂交膜上进行；

9)杂交的固相载体可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜等膜，也可以是玻璃芯片或其他高聚物；

10)通过检测标记物判断样品中是否含有特定的单核苷酸突变。

2.一种能够检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征包括：

1)通过文献检索确定HIV-1耐药主要突变位点为M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I其中之一或多个；

2)用序列分析软件分析序列并设计特异性扩增引物；

3)设计捕获探针，探针与扩增片段互补，探针3’端最后一个碱基位于突变位点的前一个碱基，所有探针退火温度控制在44至46摄氏度；

4)使用常规克隆的方法制备耐药突变位点标准品质粒；

5)摸索探针点样浓度对检测灵敏度的影响；

6)优化RT-PCR体系；

7)建立延伸反应体系；

8)对建立的方法进行灵敏度和特异性考核；

9)临床考核并与其他方法进行对比。

3.根据权利要求2所述的用于检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征在于所述的特异性扩增引物如SEQ ID NO：1-13所示。

4.根据权利要求2所述的用于检测HIV耐药突变位点的RT-PCR方法，其特征在于所述的捕获探针如SEQ ID NO：14-25所示。

5.用于延伸反应的单核苷酸用任意一种生物素或荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

6.一种用于检测HIV耐药突变位点的寡核苷酸引物对和探针的组合物。

7.一种包括权利要求5所述组合物的试剂盒。

8.权利要求6的试剂盒在检测HIV耐药突变位点的用途。