[发明专利]一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品的制备方法，特别涉及一 种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品制备方法。

背景技术

我国自本世纪初开展克氏原螯虾人工养殖以来，其养殖规模逐年扩大，占 地面积已超过了300万亩，年产量超过50万吨，成为我国淡水虾类的重要新兴 水产养殖资源。随着国内消费量和加工出口数量的增加，克氏原螯虾的野生资 源数量明显减少，因此，提高人工养殖产量以满足市场的需求已成为广大养殖 户及科技工作者为之奋斗的共同目标和重要课题。

我国的克氏原螯虾虽然已形成了规模化生产，但是制约该虾产业化发展的技 术瓶颈尚未得到有效的解决，其中比较突出的问题有克氏原螯虾规模化养殖的 苗种配套技术问题、苗种繁育率问题、亲虾和虾苗放养成活率问题等等。开展 克氏原螯虾卵巢发育机制的研究，不仅是解决上述瓶颈问题的有效途径，另一 方面，对于该物种种质资源的保护及其品种的遗传改良等具有非常积极的意义。

目前国内针对克氏原螯虾卵巢组织总蛋白作为研究对象的研究开展得较少， 且主要是利用克隆技术对组织中单一性功能蛋白进行纯化及展开性质研究，通 过类似方法无法达到全面获取克氏原螯虾卵巢组织发育分子构成，并研究其发 育机制的目的。宏蛋白质组学是最近几年被提出的新概念，其定义是指对某一 特定环境中个体(器官、组织、细胞等)的所有蛋白质进行大规模的分析和鉴 定。宏蛋白质组学的研究策略主要包括环境总蛋白的提取制备、蛋白质分离、 以及蛋白质谱鉴定和数据分析等步骤。应用宏蛋白质组学理论和思想，利用双 向电泳技术对克氏原螯虾卵巢组织所有可溶性蛋白进行高分辨率分离，能为后 续通过质谱分析手段大规模鉴定发育相关基因，并进一步了解其基因性质奠定 基础。

选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，制备方法选择不 当，会造成大量盐离子和其它干扰物质残留，严重影响等电聚焦，从而影响双 向电泳的结果。虾类卵巢组织中的所有可溶性蛋白必须尽可能地从组织中利用 破碎、裂解、并适当的缓冲体系中提取出来，要在尽可能去除多糖、脂类、核 酸等干扰性杂质的同时，尽量避免目标蛋白样品的降解和丢失。

迄今为止，没还有适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品制备方 法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可有效去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳 效果的物质，能够更加彻底地去除上述杂质的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的处 理方法，以得到更适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品的方法。

本发明的技术方案：一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品 制备方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)称取克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织500mg，放入预冷至0～-20℃的研 钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15mL离心管中；

(2)向步骤(1)中的15mL离心管中加入上述克氏原螯虾新鲜成熟卵巢 组织4～6倍体积的、冰水混合液中预冷至0℃的、以丙酮为溶剂的溶液A，充分 混匀，于0～-20℃放置2～4h，0～20℃、12000～15000r/min离心20～30min，收集 所得沉淀物；

所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为：0.01～0.03mmol/L的二硫苏糖醇、 体积浓度为15％～20％的三氯乙酸；

(3)向步骤(2)所得沉淀物中加入2mL冰水混合液中预冷至0℃的以丙 酮为溶剂的溶液B，充分混匀，于0～-20℃放置2～4h，0～-20℃、12000～15000r/min 离心20～30min，收集所得沉淀物；用上述以丙酮为溶剂的溶液B重复清洗沉淀 一次，于0～-20℃低温静置挥发残留丙酮3～5h，得蛋白沉淀；

所述以丙酮为溶剂的溶液B中的溶质为：0.01～0.03mmol/L的二硫苏糖醇；

(4)向步骤(3)中制得的蛋白沉淀中加入600μL的样品裂解液，室温下 充分裂解2～3h，得蛋白质混合液；

所述样品裂解液以体积百分含量0.5％～1％的IPG缓冲液为溶剂，其中含有 6～8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、10μL/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0.002 g/mL的溴酚蓝；

(5)将步骤(4)中蛋白混合液于4～6℃、12000～15000r/min离心20～30min， 收集上清液，即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。