[发明专利]一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法

权利要求书

1. 一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）称取克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织500 mg，放入预冷至0~-20℃的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15 mL离心管中；

（2）向步骤（1）中的15 mL离心管中加入上述克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织4~6倍体积的、冰水混合液中预冷至0℃的、以丙酮为溶剂的溶液A，充分混匀，于0~-20℃放置2~4h，0~20℃、12000~15000 r/min离心20~30min，收集所得沉淀物；

所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为：0.01~0.03 mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为15%~20%的三氯乙酸；

（3）向步骤（2）所得沉淀物中加入2 mL 冰水混合液中预冷至0℃的以丙酮为溶剂的溶液B，充分混匀，于0~-20℃放置2~4h，0~-20℃、12000~15000 r/min 离心20~30 min，收集所得沉淀物；用上述以丙酮为溶剂的溶液B重复清洗沉淀一次，于0~-20℃低温静置挥发残留丙酮3~5 h，得蛋白沉淀；

所述以丙酮为溶剂的溶液B中的溶质为：0.01~0.03 mmol/L 的二硫苏糖醇；

（4）向步骤（3）中制得的蛋白沉淀中加入600 μL的样品裂解液，室温下充分裂解2~3 h，得蛋白质混合液；

所述样品裂解液以体积百分含量0.5%~1%的IPG缓冲液为溶剂，其中含有6~8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0.002 g/mL的溴酚蓝；

（5）将步骤（4）中蛋白混合液于4~6℃、12000~15000r/min 离心20~30 min，收集上清液，即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。

2.根据权利要求1所述适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：所述步骤（2）以丙酮为溶剂的溶液A中二硫苏糖醇的含量为0.02 mmol/L，加入三氯乙酸至其终体积浓度为20%。

3.根据权利要求1所述适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：所述步骤（3）中所述以丙酮为溶剂的溶液B中二硫苏糖醇的含量为0.02 mmol/L。

4.根据权利要求1所述适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：所述步骤（4）中样品裂解液组成为8 mol/L尿素、0.02 g/mL的CHAPS、10 μL/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0.002 g/mL的溴酚蓝，溶剂为体积百分含量为0.5%的IPG缓冲液。

5.根据权利要求1所述适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：所述步骤（2）中以丙酮为溶剂的溶液A加入量为克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织体积的5倍。