[发明专利]通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种EBV特异性检测方法。特别涉及一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为嗜B淋巴细胞的人疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，还与多种淋巴系统恶性肿瘤及胃癌、乳腺癌等的发生密切相关。EBV具有潜伏感染的特点，一定条件下潜伏病毒可被激活，引起增殖性感染，感染后引起多系统病变，且临床表现也呈多样性，容易造成误诊，对人类健康危害极大。因此，对EBV感染进行检测，在诊断疾病并对疗效进行有效监测及流行病学调查中起着重要的作用。

目前诊断EBV感染的方法包括3个方面：①用疑有EBV感染的标本通过B细胞转化试验分离病毒；②应用分子生物学方法如核酸杂交、聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法直接检测临床标本中病毒基因组或其表达产物(RNA、蛋白)；③血清学检测。病毒分离和分子生物学方法都需要一定的仪器设备和专业人员操作，步骤繁琐，不适于临床应用，且某些方法不能区别EBV潜伏感染和增殖性感染，临床上应用较多的仍然是血清学检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法，将VCA p23和p18基因进行融合后再表达，以融合基因的表达产物作为ELISA检测的抗原，建立一套以p23-p18融合蛋白为抗原的VCA特异性IgM和IgG间接ELISA检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种通过EB病毒p18与p23融合衣壳抗原检测EBV特异性的方法，其特征在于：

采用重叠延伸PCR技术，借一中间接头(Gly₄Ser)₃的编码序列，将编码p23和p18编码基因在体外进行融合；

测序无误后将融合基因克隆至表达载体，利用大肠杆菌表达融合蛋白；

将表达产物纯化后应用免疫印迹法鉴定其特异性，然后以纯化融合蛋白包被ELISA反应板，优化各种成分含量及反应条件，配套商品化的辣根过氧化酶标记的羊抗人IgM、IgG及其它一系列试剂，组装成EBV VCA特异性IgM和IgG间接法ELISA诊断试剂盒；

选择相关病人进行检测，并与EB病毒血清学检测IFA法进行比较，计算所述试剂盒的敏感性、特异性、约登指数、符合率、阳性预测值和阴性预测值等指标，同时检测诊断试剂的特异性、重复性和稳定性。

本发明的积极效果在于：

人类对EBV普遍易感。EBV是一种重要的DNA病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，且与多种淋巴系统恶性肿瘤如Burkitt淋巴瘤(BL)和某些上皮细胞肿瘤如未分化的鼻咽癌(NPC)等的发病高度相关，EBV感染越来越受到人们的关注。VCA抗体的消长与疾病的发生发展有密切关系，EBV VCA抗体的检测对疾病的早期诊断、疗效观察及流行病学调查有重要意义。

本发明成功建立了EBV VCA融合抗原表达株，并用融合抗原做为ELISA包被抗原，建立了EBV VCA特异性IgG和IgM抗体间接ELISA诊断试剂盒，检测结果可靠，操作简单，易自动化，能有效检测EBV感染患者VCA抗体水平，对疾病的早期诊断、疗效观察及流行病学调查有重要意义。

本发明利用基因融合技术将EBV VCA p23和p18基因融合，并导入原核表达载体获得高效表达的融合蛋白，既利用p23和p18蛋白的高度特异性，又具备p23易于表达和p18免疫原性强的特点，Western blot显示融合抗原具有较高的特异性和敏感性。只需要作一次克隆，降低了抗原制作成本，又可同时利用多种种抗原的免疫原性，提高了检测的敏感性和特异性，还可以在基因水平控制不同抗原的比例。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明。

p23和p18融合基因的制备

(1)模板DNA的制备：以B95-8株病毒DNA为模板通过PCR获取目的基因。常规培养收获B95-8细胞，酚、氯仿、异戊醇法提取细胞DNA，步骤如下：