[发明专利]检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测动物组织(肌肉、肝脏)、水产品中呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及检测方法。

背景技术

硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用。

由于硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测，但其代谢产物因和蛋白质结合而相当稳定，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃西林作为硝基呋喃类药物的一种，代谢产物为SEM。目前用来检测硝基呋喃类代谢物的最常用方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，与之相比，酶联免疫方法具有高精确度和灵敏度、较低的操作技术要求、短暂的检测时间、较大的检测样本量等特点，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的是提供一种呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适用于进行大批量样品筛查的定性、定量检测方法。

本发明提供的呋喃西林代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括包被有包被原的酶标板、呋喃西林代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃西林代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。

本发明所提供的呋喃西林代谢物酶联免疫试剂盒，所述呋喃西林代谢物抗原为呋喃西林代谢物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

所述呋喃西林代谢物特异性抗体为呋喃西林代谢物单克隆抗体，是用呋喃西林代谢物免疫原免疫动物得到的。所述呋喃西林代谢物单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述呋喃西林代谢物单克隆抗体优选为呋喃西林代谢物鼠单克隆抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。

为了更方便的进行大量样本筛查和现场监控，所述试剂盒还包括：标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛。

所述标准品溶液为系列呋喃西林代谢物标准品溶液，浓度分别为0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L，1mL/瓶。所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液，所述底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，所述浓缩洗涤液为0.8％～1.2％吐温-20和0.01％～0.02％的叠氮化钠防腐剂的0.2～0.4mol/LpH7.6磷酸盐缓冲液，所述浓缩复溶液为pH值为7.6，含有9％～12％卵清蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液。

其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9.4～9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为pH7.4～7.6的0.05％～1％的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液。

本发明酶标板的制备主要为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.1～0.3μg/ml，每孔加入150μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，洗涤液洗涤1次，拍干，每孔中加入150μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。

本发明中包被原和免疫原的合成过程为：

1.半抗原合成(合成路线如图1)

0.75g呋喃西林代谢物(SEM)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入2.68-5.36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60℃反应2-4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色SEM衍生物。

2.免疫原的合成

(1)取呋喃西林代谢物半抗原10mg用1mlDMF溶解，得到溶液1。

(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。

(3)将溶液1滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。

(4)取NaBH₄ 14mg用0.2ml0.1M NaOH溶解后中入溶液3中，4℃反应2h。

(5)用0.01mol/lPBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。

(6)分装，于-20℃保存备用。