[发明专利]一种疱疹病毒Ⅱ型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测试剂盒及方法。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpess implex virus)属于疱疹病毒科α病毒亚科，病毒质粒大小约180纳米。人类单纯疱疹病毒分为两型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-I)和单纯疱疹病毒II型(HSV-II)。单纯疱疹病毒感染是由于人与人的接触。可引起疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、生殖器疱疹等，胎儿HSV感染发生率为0.4％～1.0％，即可引起胎儿宫内感染，诱发胎儿流产、早产、死胎和畸形，又可以感染新生儿。单纯疱疹病毒II型可引起疱疹性角膜炎、疱疹性皮肤炎、生殖器疱疹等，I型主要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。新生儿单纯疱疹病毒感染的发病率和死亡率都很高，发病率估计为活产婴儿的1/3000-1/20000，80％的病例为单纯疱疹病毒II型。HSV-II阳性的生殖器疱疹溃疡是易感染HIV的危险因素之一。有免疫功能缺陷的患者，尤其是AIDS，生殖器疱疹严重且持久，易产生广泛而持续的直肠生殖器损害。

单纯疱疹病毒侵入宿主细胞后，病毒DNA进入细胞核内复制，与此同时，病毒DNA转录物进入胞质，指导病毒结构蛋白在细胞质内的合成；随后，子代病毒DNA回到胞质内装配为具有感染性的成熟病毒颗粒。单纯疱疹病毒入侵后，可在入侵局部造成感染；但一般情况下，病毒沿该局部的神经末梢上行，传入至神经节内，经2～3天短暂时间的复制后，病毒进入潜伏感染状态健康搜索。在适当条件下，单纯疱疹病毒可被激活而大量复制，再沿该神经节的神经分支下行播散到外周支配区域组织的细胞内，导致疱疹发作。局部感染较重时，病毒可沿淋巴管上行扩散导致淋巴结炎；在机体免疫功能低下时，可形成病毒血症，发生全身播散性感染。其感染的重要特点是，病毒可长期潜伏于体内，其间可因受激惹而反复发作。

目前，HSV常用的检查有培养法、PCR试验、血清学检查及其他抗原试验等多种选择。培养法仅能检查症状的患者，在检查无症状患者样本时，其敏感度仅有20％～50％，这使得80％以上的HSV感染者直接被漏检。同时培养法也非常耗时，且需要专门的设备。由于以上问题和具有很高的特异性，培养法一般用于HSV的确诊和法医学鉴定。在细胞学检查中，可检出HSV感染特征性的多核巨细胞内的嗜酸性包涵体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60％。另外，免疫酶方法(ELISA)是一种将抗原的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法，但在快速和定量检测自动化上仍有较多工作做。免疫荧光法(IFA)在检查无症状患者样本时，其敏感度可达到35％～70％，且可以在几个小时内出报告。但该方法目前的主要问题是其结果判断的经验依赖性较高。乳胶凝集试验(LA)是将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSVAg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集，问题是敏感性较差。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。随着荧光PCR技术与相关PCR仪的出现，彻底改变了以往利用末端法对基因进行定量的方法。

实时荧光PCR的优点是显而易见的，由于省去了PCR后处理的过程，不仅大大提高了样品的分析速度，降低了扩增产物污染的可能性(这一点对经常进行重复测定的临检部门尤其重要)，又避免了PCR后处理过程引入的误差，代表了PCR测定技术的发展趋势，无疑也是临床诊断的理想选择。

常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏的优势，但是有不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题，因此有必要开发一种精确、灵敏快速、稳定的临床检验方法。

发明内容

本发明目的是提供一种疱疹病毒II型PCR荧光定量快速检测试剂盒，包括DNA提取液，PCR反应液，DNA聚合酶，阳性质控品，弱阳性质控品，阴性质控品，定量参比品，，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；

上游引物：5′-CCCAAGCTCCCGCTAAGG-3′；

下游引物：5′-CGCCTTGGCAGCACAACT-3′；

荧光探针：5′-FAM-CCTGCTCTAGATATCCT-TAMRA-3′。