[发明专利]一种角类多肽、其分离方法及抗氧化用途

说明书

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具备涉及一类具有抗氧化活性的角类多肽、其分离方法及用途。本申请为200910233784.1的分案申请。

背景技术

角类动物药材是祖国医学宝库的重要组成部分，其功效确切，作用特点突出。中国现已知最早的本草著作《神农本草经》中就已经记载了犀角(Cornu Rhinoceri Asiatici)和羚羊角(Cornu Saigae Tataricae)的性味与功效，而后汉代《名医别录》中出现了关于水牛角(Cornu Bubali)性味与功效的记载。千百年来，犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材一直是中医临床不可或缺的要药，主要用于治疗热证。然而，目前法律已经明令禁止使用及交易犀角及其制品，赛加羚羊作为濒危物种，其角的使用也受到限制，只有水牛角因取材广泛，价格低廉，疗效确切而被沿用至今。从20世纪60年代起，科研人员就开始对多种角类药材进行比较研究与评价，结果认为水牛角在氨基酸组成、宏微量元素组成、药理药效作用等方面与犀角相似且功效确切，因此目前中医普遍采用水牛角及水牛角浓缩粉代用犀(广)角用作医药工业和临床调剂，取得良好的效果，以缓解中医临床千年来对于犀(广)角使用的依赖性。

水牛角Cornu Bubali为牛科动物Bubalus bubalis Linnaeus的双角，为2005版《中华人民共和国药典》收载品种，性味苦，寒，归心，肝经。水牛角主要含有角蛋白、多肽、氨基酸、胆固醇等物质，具清热解毒、凉血、定惊等功效，中医临床以直接煎汤或入方剂煎汤服用，主要用于治疗温病高热，神昏谵语，发斑发疹，吐血衄血，惊风，癫狂等证。

虽然犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材应用历史逾千年，但因药材来源部位、材质、组成成分等特殊性，其效应物质基础与作用机制的研究还较为薄弱，关于其活性成分的报道几乎为零。因此，如何充分利用现代生物技术手段，从角类药材中分离纯化活性多肽并进行结构鉴定，深入开展研究角类药材效应物质基础与作用机制研究，是该领域科研技术人员多年来努力寻求突破的研究方向之一。

发明内容

本发明采用现代生化技术手段，对水牛角中具有抗氧化活性多肽成分进行跟踪，进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的结构进行分析鉴定。

本发明公开了下列3种结构式的多肽：

Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；

Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；

Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn(III)。

它们均分离自水牛角，也可人工合成。

从水牛角分离的方法包括：

a、取水牛角粉，用纯水加热回流提取，滤过，滤液浓缩冷冻干燥，得粗提物；

b、对粗提物进行凝胶柱层析分离，在254nm下检测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，测定抗氧化活性；

c、将最高抗氧化活性的组分进一步利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化，离子交换柱先用50mM磷酸盐缓冲液(PBS)pH6.5，以1ml/min流速预处理3h；上样后，离子交换柱用50mM PBS pH6.5，以1ml/min流速洗脱2h，然后以线性梯度为0-0.3M NaCl的PBS缓冲液50mM，pH6.5洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；根据洗脱峰收集每个组分，冷冻干燥；

d、将c得到的冻干粉，纯水溶解成较高浓度，通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进行脱盐，测定抗氧化活性，得到较好抗氧化活性组分D2和D3；

e、将组分D2和D3，再通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2％-60％甲醇洗脱，其中含0.1％三氟乙酸，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4.6min和7.3min的两个色谱峰，分别为多肽I和II；D3组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为5.4min的色谱峰，为多肽III；收集得到的样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；分别得到多肽I，II和III的冻干粉。

上述分离纯化方法纯化的活性多肽I、II、III的分子量分别为708.090Da，1018.296Da和1271.379Da。结构式：

Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；