[发明专利]弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条及其制备方法

权利要求书

1.弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条，其特征在于设有载体板、加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜、弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线、对照线和吸收垫；所述加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体。

2.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条，其特征在于所述载体板为PVC板。

3.如权利要求1所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7：采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2)硝酸纤维素膜的点样：在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在硝酸纤维素膜上的对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，晾干；

3)制备胶体金：采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存备用；

4)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记：

(1)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)的标记：取胶体金10ml，用0.1mol/L NaOH调至pH5.4，加100μg SAG1(P30)，混匀，放置5min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS稀释至1ml，得胶体金标记的SAG1(P30)抗原；

(2)胶体金与弓形虫抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记方法与步骤(1)相同，得胶体金标记的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

5)制备弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条：

将加样垫、胶体金垫、硝酸纤维膜和吸收垫依次粘贴在载体板上表面，加样垫的一端设在胶体金垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸收垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线、弓形虫IgM抗体检测线和对照线依次设在硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在弓形虫IgM抗体检测线处包被抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体，在对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条。

4.如权利要求3所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体、抗人IgM特异性片段μ链单克隆抗体的浓度为1～4mg/mL。

5.如权利要求3所述的弓形虫IgM与IgG抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体由抗SAG1(P30)-IgG抗体、抗SAG2(P22)-IgG抗体、抗ROP2-IgG抗体与抗GRA7-IgG按体积比1∶1∶1∶1混合，其终浓度为1～4mg/mL；四者点样量为1μL/cm。