[发明专利]一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种日本乙型脑炎病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

日本乙型脑炎，又称流行性乙型脑炎（简称乙脑），是由日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus, JEV）引起的。流行广泛，主要通过蚊子传播，是严重威胁人畜健康的一种急性传染病，也是我国及亚洲地区夏秋季流行的主要传染病之一。

JEV是单股正链RNA，长约11kb，分子量约4.2×10⁶D，在CsCl中的浮密度为1.24~1.25g/ml。病毒由脂质双层包裹核衣壳，基因组5’端的帽子结构m7GpppAmp，对感染性和稳定性无影响，其后是保守的AG序列。3’末端为CU_OH，不含polyA尾。病毒RNA只有一个开放阅读框架（ORF），在ORF两侧5’端大约95bp，3’端有大约582 bp的非编码区，顺序为NH₂-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH。根据已明确的黄病毒相关区域蛋白功能特点分析，与免疫研究有关的基因主要集中与PrM、E及NS1蛋白编码基因上。

JEV的结构蛋白包括C蛋白、M蛋白和E蛋白。C蛋白（核衣壳蛋白）分子量13.9kDa，由120个氨基酸组成，其39~54位氨基酸序列在黄病毒属中具有保护性。C端疏水性氨基酸将其固定在宿主细胞的粗面内质网膜上，以便装配成包裹基因组的核衣壳，使之免受核酸酶的破坏。M蛋白（膜蛋白）分子量8.3 kDa，由75个氨基酸残基组成，前体蛋白PrM对E蛋白的正确折叠、定位于膜上和最后的装配至关重要。在病毒粒子释放同时或释放之前一瞬间，PrM切割形成M蛋白。PrM切割不完全就成为中和抗体的靶子。利用表达JEV的PrM及E蛋白的质粒载体转染COS-1细胞，在培养液中检测到类病毒颗粒，用质粒作基因疫苗免疫老鼠表达中和抗体活性。PrM是病毒诱发保护性免疫的协同成分，M蛋白能诱发轻度中和抗体。E蛋白是主要结构蛋白，影响病毒毒力，病毒入侵和病毒的免疫原性。分子量53 kDa，含500个氨基酸残基，甘氨酸和丙氨酸含量最高。E蛋白中高甘露糖侧链的存在对病毒蛋白的抗原性有重要影响。E蛋白是主要的囊膜蛋白和毒粒表面最中药的成分，它与病毒粒子的吸附、穿入、致病等密切相关。E蛋白也是体外中和作用的主要靶位点、FEV特异性抗体的作用位点；具有血凝活性和中和活性，能和血凝抑制抗体结合，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。目前针对黄病毒的疫苗大多包含E蛋白中的抗原表位。

病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs）是含有某种病毒的一个或者多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装，这为病毒的基础研究（基因治疗、药物治疗等）及疫苗的开发提供了便利条件。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。

国内外目前虽然已经有日本乙型脑炎病毒样颗粒报道，但因公认的黄病毒5’端的蛋白的不稳定性或毒性原因，存在一定的问题。现在的研究热点主要集中在结构蛋白的长度选取、表达的载体系统、表达的哺乳动物细胞、转染复制子载体的结构等方面。本研究中所采用的Tet-on advance表达系统是改进型表达系统（具有更高的灵敏性，更低的本底表达和诱导后极高的表达，诱导水平可以增加100倍，表达量比常规的CMV启动子要高很多），该系统具有严密性、特异性、高效性等优点，被认为是目前最理想的真核基因表达调控系统之一，在没有四环素的情况下表达水平为零，非常适用于不稳定或毒性基因的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种日本乙型脑炎病毒样颗粒。

本发明的另一目的是提供上述日本乙型脑炎病毒样颗粒的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述日本乙型脑炎病毒样颗粒的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：