[发明专利]检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可同时快速检测水产品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌(Vibrio.parahaemolyticus)和副溶血性弧菌(Staphylococcus aureus)的多重PCR试剂盒和改良型检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

近几年我国水产品消费量不断上升，而水产品在养殖、捕捞、储藏、加工、运输、销售等环节容易受到病原微生物的污染，因此病原微生物检测是水产品及其加工品卫生检测中的一项重要工作，其关系到消费者的健康及生命安全。其中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌被认为是重要的污染水产品的致病菌，已引起各个国家卫生检测部门的广泛重视。我国标准DB11/519-2008《生食水产品卫生要求》规定沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌等不得检出。严格的食品微生物检验是保障食品安全的重要环节。然而，传统检测方法检测时间长，一般检测周期在5-10天，检测程序繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的现代化检测方法。

分子生物学检测技术的发展为病原微生物快速检测提供了良好的技术平台，如基因探针、NASBA(核酸序列依赖性扩增法)、ATP生物发光法以及PCR等技术已逐渐被研究并完善以用于病原微生物的检测当中。其中多重PCR(multiplex-PCR)技术不同于传统PCR技术只能检测单一靶基因，其是通过在同一PCR反应体系里加入多对特征引物，同时扩增出多个目标核酸片段的PCR反应，可用于多种病原微生物的同时快速检测或鉴定。Germini等根据沙门氏菌的invA基因，单核细胞增生李斯特菌的prfA基因，大肠杆菌O157:H7的eaeA基因以及细菌的16S rRNA基因设计引物，应用多重PCR技术对全蛋液进行测定，特异性地检出上述菌种，灵敏度高，检测效果稳定。国内陈伟等对肉品中的沙门氏菌、志贺氏菌及大肠杆菌0157:H7三种致病菌建立了多重PCR检测体系，检测灵敏度可达1CFU/ml，可在24h内完成检测工作，并集成了快速检测试剂盒。然而，目前对水产品中常见的四种致病菌沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的同时共增菌方法及多重PCR快速检测试剂盒未有报道和公开。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于同时检测水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌四种常见致病菌的多重PCR快速检测试剂盒和检测方法，可以有效的节约检测时间，提高检测效率。

检测水产品中四种常见致病菌的试剂盒，包括Mg²⁺、dNTP、Taq酶、PCR Buffer、引物、灭菌双蒸水，其特征在于，所述引物由以下序列组成：

沙门氏菌引物上游序列：5’-GGT CGT CGT TGG GAC TGA TTG G-3’，下游序列：5’-CCG TGG CAT GTC TGA GCA CTT C-3’；

志贺氏菌引物上游序列：5’-GCT CGA AAC GGG CTG TGC TAA TG-3’，下游序列：5’-ACG GTA TCG GAA AGG CGG TCAA-3’；

金黄色葡萄球菌引物上游序列：5’-AAC GGC AAT ACG CAA AGA GG-3’、下游序列：5’-TAT ACG CTA AGC CAC GTC CAT A-3’；

副溶血性弧菌引物上游序列：5’-CTG ATA ACA ATG ACG CCT CTG CTA AT-3’，下游序列：5’-TCT GAT ACT CAC CAA TCT GAC GGA ACT-3’。

本发明根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH、副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR作为特征靶基因设计出4对特异性引物(见表1)各引物针对相应致病菌高度种内保守，种间特异基因或者毒力相关基因设计。扩增后片段长度大小各异，可通过电泳进行分开辨别。

表1四种目标菌的引物序列和扩增PCR产物大小

本发明还提供了一种于同时检测水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌四种常见致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：