[发明专利]固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工业生物技术领域，涉及一种固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法。

背景技术

非天然氨基酸结构和功能多样，是很多药物合成中常用的中间体，例如L-叔亮氨酸。

α-酮酸(化合物式1)通过生物催化可生成非天然氨基酸(化合物2和化合物3)。

R代表脂肪侧链如：-(CH₂)_nCH₃或-C(CH₃)₃等；或芳香侧链如：Ph(苯基)或Bn(苄基)。

生物催化法中使用的辅酶NAD⁺可用于底物转化，但不可再生，需要补充入新的辅酶。因此，若能使反应过程中辅酶再生，则可以大大降低成本。以三甲基丙酮酸为底物酶法合成L-叔亮氨酸需要亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，其中甲酸脱氢酶用于再生辅酶。

发明内容

本发明旨在提供一种固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法。

技术方案为，包括以下步骤：

(1)将固定化全细胞催化剂、α-酮酸盐、甲酸铵及磷酸缓冲液混合，在pH6.0～9.0、25～40℃条件下反应5～20小时(优选ph＝8.0，温度30℃)；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为10～200g/L，α-酮酸盐浓度为100～1000mmol/L，甲酸铵浓度为500～1500mmol/L；

所述的固定化全细胞催化剂中含有重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因。

(2)回收固定化全细胞催化剂，反应液降温至5～15℃，ph调节至13～14；5～15℃下，滴加氯甲酸甲酯，搅拌反应8～16小时；ph调节至1.5～3，5～15℃下，萃取洗涤干燥。

步骤(1)中还加入NAD⁺，浓度为0.05～0.5g/L。

所述α-酮酸盐结构如式1所示，

R为脂肪侧链、苯基或苄基。

优选为三甲基丙酮酸钠盐。

所述亮氨酸脱氢酶基因序列和甲酸脱氢酶基因序列分别如SEQID No.1及SEQ ID No.2所示；亮氨酸脱氢酶基因选自球形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌；甲酸脱氢酶基因选自路德酵母或博伊丁假丝酵母。

亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶氨基酸序列SEQ ID No.3及SEQ IDNo.4所示。

固定化全细胞催化剂包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶，制备方法为：

(1)将含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组质粒转入大肠杆菌宿主菌，得到重组细胞；

(2)将重组细胞与固定剂溶液混合，铺于平面上，25～35℃下保温1～1.5小时，并用盐溶液稳定后洗涤；

固定剂为聚乙二醇与聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中至少一种的混合物；

聚乙二醇的浓度为0.08～0.1g/ml；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙浓度为0.1～0.2g/ml。

本发明利用包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂还原α-酮酸(化合物1)制备非天然氨基酸(化合物2和化合物3)。

优选的，以三甲基丙酮酸为底物酶法合成L-叔亮氨酸需要亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶(用于辅酶再生)，将不同来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase，LeuDH)和甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH，辅酶再生用)克隆到重组大肠杆菌中共表达，并将细胞固定化。

本发明利用固定化重组全细胞催化合成非天然氨基酸，如L-叔亮氨酸，不用加入“外来”辅因子而对底物进行转化。且固定化全细胞催化具有成本低，操作方便的优点，

这种非天然氨基酸的合成方法属于生物合成法，反应条件温和，作用专一，无副产物，在医药及食品等行业中均有应用价值。

附图说明

图1是质粒pACYCDuet-1-BsLeuDH的图谱。

图2是质粒pET21a-LeFDH的图谱。

图3为实施例7核磁共振检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：

实施例1 重组质粒pACYCDuet-1-BsLeuDH的制备：