[发明专利]固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法

权利要求书

1.固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将固定化全细胞催化剂、α-酮酸盐、甲酸铵及磷酸缓冲液混合，在pH6.0～9.0、25～40℃条件下反应5～20小时；反应混合液中固定化全细胞催化剂湿重浓度为10～200g/L，α-酮酸盐浓度为100～1000mmol/L，甲酸铵浓度为500～1500mmol/L；

所述的固定化全细胞催化剂中含有重组细胞，重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因；

(2)回收固定化全细胞催化剂，反应液降温至5～15℃，ph调节至13～14；5～15℃下，滴加氯甲酸甲酯，搅拌反应8～16小时；ph调节至1.5～3，5～15℃下，萃取洗涤干燥。

2.权利要求1所述固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，步骤(1)中还加入NAD⁺，浓度为0.05～0.5g/L。

3.权利要求1所述固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述固定化全细胞催化剂的制备方法为：

(1)将含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组质粒转入大肠杆菌宿主菌，得到重组细胞；

(2)将重组细胞与固定剂溶液混合，铺于平面上，25～35℃下保温1～1.5小时，并用盐溶液稳定后洗涤；

固定剂为聚乙二醇与聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中至少一种的混合物；

聚乙二醇的浓度为0.08～0.1g/ml；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙浓度为0.1～0.2g/ml。

4.权利要求1所述固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述α-酮酸盐结构如式1所示，

R为脂肪侧链、苯基或苄基。

5.权利要求1或4所述合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，步骤(1)中的α-酮酸盐为三甲基丙酮酸钠盐。

6.权利要求1所述固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因序列和甲酸脱氢酶基因序列分别如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示。

7.权利要求1或6所述固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因选自球形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌；甲酸脱氢酶基因选自路德酵母或博伊丁假丝酵母。