[发明专利]红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法

说明书

技术领域

本发明涉及关于红树植物的蛋白组学，尤其涉及其总蛋白的提取以及双向电泳方法。

背景技术

红树林（mangrove）是一种稀有的木本胎生植物。它生长于热带和亚热带陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，是陆地向海洋过度的特殊生态系统。红树林肩负优化环境和促进经济社会发展的双重使命，有着无可比拟的生态价值，在防风消灾、提高生物多样性、净化大气和水体环境等方面具有重要的生态意义和巨大经济价值，也是中国南部沿海区域生态平衡最重要的生态安全保障体系之一。尤其红树林生态系统产生的生态、经济、社会、文化、再造功能及其他价值，已在中国和世界受到广泛重视。随着全球气候的变暖，产生了应对气候变化红树林北移现象。随着科技的进步，人们发现基因表达产物——蛋白质的变化，是导致生命功能失常的直接因素。因此对红树植物耐寒性蛋白的研究对于应对气候变化红树林北移的研究具有重要意义。

双向电泳是研究蛋白质表达变化最有效的工具之一。它利用等电点和分子量两个性质对蛋白质进行分离,可以使样品中的数千种蛋白质得到很好的分离。而蛋白质的样品制备是双向电泳的关键步骤，但是由于植物组织由于富含色素、多酚、多糖、有机酸等次生代谢物质和蛋白酶,其蛋白样品制备一直较为困难。红树植物又生长在陆地与海洋交界带的滩涂浅滩，因其特殊的生长环境，在其化学成分和生理活性方面都具有很多特殊性，其体内除含有多种次生代谢物质外还含有大量盐分和单宁,盐离子的存在严重干扰等电聚焦的进行，单宁根据结构的不同可分为：水解单宁和缩合单宁，缩合单宁能与蛋白质结合并形成复合物，严重影响蛋白质的提取分离。因此，红树植物蛋白质提取较其他植物更为困难，具有其特殊性和复杂性。而双向电泳技术在植物中的应用主要集中在水稻、小麦或其他一些草本植物上，在红树植物中的应用报道较少。

发明内容

为方便对红树植物蛋白质做进一步的研究和分析，本发明提供经济、简便、易行、快速的适用于红树植物的总蛋白的提取以及双向电泳方法，经反复实验证明该方法样品制备的重复性好且图谱清晰。

本发明提供的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，技术方案是依次进行下列步骤：

a、将定量的红树植物叶片置于液氮中研磨充分，将粉末转至离心管中，加入4倍体积20%的TCA-丙酮溶液，涡旋混匀后，置于低温下沉淀；

b、离心后收集沉淀，将该沉淀用预冷的丙酮洗涤，于低温高速涡旋离心后收集沉淀，再将沉淀置于室温晾干；

c、向步骤b得到的沉淀加入裂解缓冲液，低温下溶解后离心，取上清液为蛋白提取样品；

d、用Bradford法测定步骤c得到的蛋白提取样品的蛋白质含量；

e、进行第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：将步骤c得到的蛋白提取样品以及含电泳指示剂的上样缓冲液加入聚焦盘中，将IPG胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油，设置好等电聚焦程序；

f、进行胶条平衡：等电聚焦后的IPG胶条依次在第一平衡缓冲液和第二平衡缓冲液中平衡，然后转移至SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶；

g、进行第二向SDS-PAGE电泳：先用低电流的恒流电泳，再加大电流直至电泳指示剂到达胶的底端即可停止电泳。

h、取步骤g电泳后得到的凝胶进行高灵敏度染色。

本发明所提供的技术方案可专门适用于红树植物的蛋白质提取以及双向电泳方法。因为TCA和丙酮可用于沉淀蛋白质和双向电泳样品制备过程中去除单宁和盐分，但是过高的TCA浓度在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐，且TCA可能渗入高丰度蛋白质分子内部而难以完全除去，也会影响高分子蛋白的提取，不易被丙酮彻底抽提，因此TCA的浓度是影响红树植物蛋白质提取的主要因素，过高或过低的TCA浓度都将影响到蛋白质的提取及其后续电泳的效果。本发明步骤a使用20%TCA-丙酮溶液提取蛋白质，20%的TCA可以更好的去除盐离子，其中80%浓度的丙酮则对蛋白质与缩合单宁的复合物的分离作用效果显著，可较好分离该复合物，去除单宁，提高蛋白质浓度，用20% TCA-丙酮所提取的红树植物蛋白质含量较高，2-DE电泳图谱清晰，且操作简单，重复性好，试剂毒性较低。