[发明专利]红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法

权利要求书

1.一种红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于依次进行下列步骤：

a、将定量的红树植物叶片置于液氮中研磨充分，将粉末转至离心管中，加入4倍体积20%的TCA-丙酮溶液，涡旋混匀后，置于低温下沉淀；

b、离心后收集沉淀，将该沉淀用预冷的丙酮洗涤，于低温高速涡旋离心后收集沉淀，再将沉淀置于室温晾干；

c、向步骤b得到的沉淀加入裂解缓冲液，低温下溶解后离心，取上清液为蛋白提取样品；

d、用Bradford法测定步骤c得到的蛋白提取样品的蛋白质含量；

e、进行第一向固定pH梯度等电聚焦电泳：将步骤c得到的蛋白提取样品以及含电泳指示剂的上样缓冲液加入聚焦盘中，将IPG胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油，设置好等电聚焦程序；

f、进行胶条平衡：等电聚焦后的IPG胶条依次在第一平衡缓冲液和第二平衡缓冲液中平衡，然后转移至SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶；

g、进行第二向SDS-PAGE电泳：先用低电流的恒流电泳，再加大电流直至电泳指示剂到达胶的底端即可停止电泳；

h、取步骤g电泳后得到的凝胶进行高灵敏度染色。

2.根据权利要求1所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于所述步骤e的等电聚焦程序包括依次进行下列步骤：无电压慢速水化4小时，250伏电压慢速水化0.5小时，500伏电压慢速除盐0.5小时，1000伏电压快速除盐1.5小时，1000伏电压线性升高至10000伏电压3小时，10000伏电压聚焦65000总电压时间积，500伏电压保持18小时。

3. 根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤c中的裂解缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS，40mmol/L Tris，2mmol/L TBP，0.2% Bio-lyte。

4.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e中的上样缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝。

5.根据权利要求3所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e中的上样缓冲液包括2mol/L 硫脲，7mol/L 尿素，4% CHAPS,40mmol/L Tris，2mmol/L TBP,0.2% Bio-lyte，0.001%溴酚蓝。

6.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤f中的第一平衡缓冲液包括1%DTT，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油，所述步骤f中的第二平衡缓冲液包括2.5%碘乙酰胺，6mol/L尿素，2%SDS，50mol/LTris-HCl，Ph8.8的20%甘油。

7.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤c得到蛋白提取样品后用clean-up试剂盒纯化。

8.根据权利要求1或2所述的红树植物总蛋白的提取以及双向电泳方法，其特征在于：所述步骤e使用的IPG胶条规格为pH3-10NL。