[发明专利]口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种口蹄疫疫苗及其制备方法，特别涉及一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法及由该制备方法得到的口蹄疫纯化疫苗，还涉及得到的口蹄疫疫苗在制备预防动物口蹄疫药物中的应用。属于疫苗制备领域。

背景技术

随着家畜集约化养殖水平的提高，尤其是奶牛饲养量的增大，疫苗的轻微副反应，就可带来巨大的经济损失，如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等，无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。

现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题：1.免疫保护力不稳定，主要表现在：免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低，或者免疫期较短，只有2～3个月；2.免疫副反应大，主要是：下游生产工艺仍为传统方法，未经纯化处理，疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质，而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。

近些年来，国内外关于疫苗分离纯化的研究群雄并起，异军突起，成绩斐然。在人用生物制品中，通过FDA认证的疫苗已有上百种，而正在研制开发中的疫苗达数千种之多，有关疫苗研究的科学论文和专利几乎都涉及到分离纯化技术，近年来这类文献呈现指数增长态势。但分离纯化技术仍未在兽用疫苗的生产中得到应用。随着我国畜牧业的发展，人们对兽用疫苗纯度和安全性等提出更高要求。

疫苗的分离纯化主要是去除培养基和宿主细胞中的杂蛋白、肽、核酸及污染菌和它产生的内毒素，传统的蔗糖密度梯度离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的抗原纯化中仍被普遍采用，但绝大部分是简单分离得到的粗制疫苗，其中抗原含量较低，且可能含有一些杂质和过敏性物质，这些传统疫苗的处理方法一般均存在纯度、活力以及安全性偏低，不适合应用于规模化生产等缺点，满足不了新疫苗的研制和生产的需要。

疫苗的纯化以层析法提纯最为可靠，目前应用的领域仅限于人用生物制品，如乙肝、狂犬、出血热、流感、小儿麻痹疫苗等少数一些病毒性疫苗的研究和生产中。国内外尚未有用层析技术进行兽用疫苗纯化的报道。

本项目发明技术的突破，不仅提高我国动物疫苗生产工艺水平和疫苗质量，推动我国兽用疫苗行业的发展，而且将促使我国从疫苗生产大国向疫苗生产强国发展，合乎世界生物制药发展趋势，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种制备口蹄疫纯化疫苗的方法，本发明的一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括：将经过细胞悬浮培养的口蹄疫病毒液中的细胞碎片去除后，浓缩至适当倍数，用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸，离心，上清液通过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析进行洗脱，收集第一个洗脱峰，过滤除菌后灭活，加入佐剂进行乳化，分装即得。

本发明所述的制备方法，其特征在于具体的包括以下步骤：

(1)将口蹄疫病毒种毒接种悬浮培养的BHK21细胞，继续悬浮培养15～28小时；

(2)收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒，通过微孔过滤系统去除细胞碎片，得到微滤液；

(3)微滤液浓缩至微滤液原体积的1/10-1/100，得到微滤液的浓缩液；

(4)向步骤(3)得到的浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白，使硫酸鱼精蛋白的终浓度达到1.0mg/ml～2.5mg/ml的，室温(25℃)搅拌0.5h～2.0h，静置作用0.5h～2.0h后，5000rpm～10000rpm离心15min～60min，弃沉淀，取离心上清，得到浓缩口蹄疫病毒上清液；

(5)将聚丙烯酰胺葡凝胶装入层析柱，用1～2倍柱体积的PH7.4～8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡该层析柱，将步骤(4)离心获得的浓缩口蹄疫病毒上清液加于该聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶上面，待病毒液全部进入凝胶之后，再用PH7.4～8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱；

(6)收集第一个洗脱峰，过滤除菌后用1mM～3mM的BEI 30℃灭活28小时，灭活液经2～10倍稀释后(用PH7.4～8.0的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，具体实施例中有记载)，按1∶1重量比加矿物油佐剂乳化，分装得口蹄疫纯化疫苗。

在本发明中，所述的口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。这是因为本发明的口蹄疫病毒的柱层析纯化方法的根据是完整口蹄疫病毒粒子大小，而口蹄疫病毒各型毒株的完整口蹄疫病毒粒子大小是一样的，因而口蹄疫病毒各种血清型疫苗毒株均可采用本发明的方法进行纯化疫苗的制备。