[发明专利]口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种口蹄疫纯化疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将经过细胞悬浮培养的口蹄疫病毒液中的细胞碎片去除后，浓缩至适当倍数，用硫酸鱼精蛋白沉淀去除大部分宿主细胞杂蛋白和核酸，离心，上清液通过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析进行洗脱，收集第一个洗脱峰，过滤除菌后灭活，加入佐剂进行乳化，分装即得。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)将口蹄疫病毒种毒接种悬浮培养的BHK21细胞，继续悬浮培养15～28小时；

(2)收获经过BHK21细胞悬浮培养的口蹄疫病毒，通过微孔过滤系统去除细胞碎片，得到微滤液；

(3)微滤液浓缩至微滤液原体积的1/10～1/100，得到微滤液的浓缩液；

(4)向步骤(3)得到的浓缩液中加入硫酸鱼精蛋白，使硫酸鱼精蛋白的终浓度达到1.0mg/ml～2.5mg/ml，室温搅拌0.5h～2.0h，静置作用0.5h～2.0h后，5000rpm～10000rpm离心15min～60min，弃沉淀，取离心上清，得到浓缩口蹄疫病毒上清液；

(5)将聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶装入层析柱，用1～2倍柱体积的PH7.4～8.0的0.01M的磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将步骤(4)离心获得的浓缩口蹄疫病毒上清液加于聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶上面，待病毒液全部进入凝胶之后，再用PH7.4～8.0的0.01M磷酸盐缓冲液进行洗脱；

(6)收集第一个洗脱峰，过滤除菌后用1mM～3mM的BEI 30℃灭活28小时，灭活液经2-10倍稀释后，按1∶1重量比加矿物油佐剂乳化，分装得口蹄疫灭活疫苗。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的微孔过滤系统为孔径为5微米，1微米和0.45微米的滤芯一起联合使用或者孔径为5微米，1微米和0.45微米的振动筛一起联合使用，或者孔径为5微米，1微米和0.45微米中空纤维柱一起联合使用。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的浓缩为使用PEG6000进行病毒沉淀浓缩或者使用截留分子量为6kd-20kd的中空纤维柱或者截留分子量为6kd-20kd的膜包进行浓缩。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶为组分收集范围为1.0×10⁴～1.0×10⁸球蛋白分子量的高分辨率聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶组分收集范围为1.0×10⁴～1.5×10⁶球蛋白分子量。

8.由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的口蹄疫纯化疫苗。

9.权利要求8所述的口蹄疫纯化疫苗在制备预防动物口蹄疫疾病药物中的应用。