[发明专利]多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法。

背景技术

目前国际上公认的李斯特菌共有6种：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌）、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔李斯特菌(Listeria welshimeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)和西尔李斯特菌(Listeria seeligcri)。其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一；绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；英诺克李斯特菌在近期国内外报道存在食品中，对人类具有一定的潜在致病性。尤其在发生由非溶血性变为溶血性的变异时，有致病的潜力；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。

从上世纪80年代起，美国、日本、新西兰、德国、英国、法国、欧洲等国家多次因食品污染爆发人类李斯特菌病。至2003年，我国有报道的散发性李斯特菌病例150例，死亡率26%。2008年，加拿大共发生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。

目前，鉴定李斯特菌的方法主要分为两类：一类是传统的生化鉴定方法，包括微量生化反应方法和血清学方法等。另一类是分子生物学方法，包括普通PCR方法和实时荧光PCR方法等。传统方法费时、费力，且实验重复性相对较低，但其准确性使很多国家在制定标准时依然采用传统方法。分子生物学方法鉴定细菌具备快速、简便的特点，但在准确性和特异性方面尚有需要改进之处。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法；本发明是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高效率，节约时间，而且节省检测成本。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5）结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230～250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650～660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460～470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360～370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860～870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。

所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。