[发明专利]多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法

权利要求书

1.一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物5 μL点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0.5 μg/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5）结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230～250 bp条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650～660 bp条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460～470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360～370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860～870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。

2.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于：所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。

3.如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的PCR反应条件如下：95 ℃变性3 min；95 ℃15 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，进行30个循环扩增；72 ℃延伸5 min。

4.如权利要求3所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述PCR反应体系如下：

10×扩增缓冲液 　         5 μl；

　 4种dNTP混合物 　  各200 μmol/L ；   　

   引物 　　　　 　   各0.5 μmol/L；　

 DNA模板　　　 　       2 μg；　  　

 Taq DNA聚合酶 　        2u；　   　 

MgCl₂　　　　　       1.5 mmol/L； 加双蒸水至 　           50 μl；

其中所述的4种dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP ，脱氧胞苷三磷酸dCTP。

5.如权利要求4所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的扩增缓冲液配方为：pH 8.8，25℃，100 mM Tris-HCl；500 mM， KCl；0.8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇。

6.   如权利要求1所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为：取5种李斯特菌的标准菌株细菌培养液1 ml或者是待检菌液1 ml，置于无菌的1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μl裂解液混匀，置于37 ℃水浴1 h；然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3  mol/L ，pH8.0的醋酸钾，-20 ℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μl TE溶液（上海索莱宝生物科技有限公司）中，置4 ℃保存备用。

7.如权利要求6所述的一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于所述的裂解液配方为：40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA，1%十二烷基硫酸钠（SDS），pH7.8。