[发明专利]重组人促卵泡激素及其制备

说明书

发明领域

本发明属于蛋白质技术领域，具体而言，本发明涉及高比活性的重组人促卵泡激素和其制备方法。另外，本发明还涉及该制备方法中所用的中间体。

背景技术

促卵泡激素(FSH)是调节雌性和雄性哺乳动物(包括人类)的生殖相关功能的重要激素，可用于治疗不排卵综合症、黄体缺陷以及不育症等。FSH是一个异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α和β亚基结合而成。其中，α亚基和β亚基均为糖蛋白，各分布有2个糖基化位点。FSH的糖基结构部分的存在及组分决定了其生物学功能的性能及稳定性。而对于经历翻译、剪接和折叠才得到的蛋白质产物来说，其活性已经难以预料，而糖基化的存在与组分为预测蛋白质产物的性质带来了更大的难度，以至于美国FDA感叹道：“生物制品的生产过程就是产品”。

对于FSH的制备，中国专利第88103966号公开了采用免疫层析和逆相HPLC步骤从绝经后尿促性腺激素中纯化人FSH(hFSH)。此后，DNA重组制备的hFSH(rhFSH)的方法也有报道。例如，中国专利第98807811号致力于通过引入二硫键来稳定FSH，而中国专利第99808813号和第200480032665号则通过引入一些突变来提高性能及稳定性，但是这些蛋白结构的改变将增加该突变的FSH被机体识别为异源蛋白的隐患，从而在体内使用时带来免疫风险。

中国专利第200480036591号、第200580037591号、第200910048718号和第200910051483号通过后期纯化步骤的优化来提高hFSH的性能及稳定性，最终得到的高纯度的FSH的比活达到12104IU/mg。

本发明人研制了不同于现有技术的FSH制备方法，在DNA水平上做了大幅度的优化，但不在最终产物的蛋白质水平上引入突变，即最终产物与天然hFSH的蛋白质一级结构相同，翻译产物正确，避免了体内用药时的免疫风险；另外在转染、培养以及后期纯化中进行了全面优化。最终，本发明人不但获得了表达水平高的rhFSH，更令人意想不到的是，获得的rhFSH的活性进一步得到了提高，比活高于现有技术所报道的。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供不同于现有技术的rhFSH的制备方法，该方法获得的最终产物正确，保留了FSH的生物活性。另外，本发明还提供了该方法制备而得的rhFSH以及该方法中使用的中间体。

具体而言，在第一方面，本发明提供了高比活性的重组促卵泡激素，其比活性大于12200IU/mg，优选大于12300IU/mg，最优选为12350～12400IU/mg，如12390IU/mg。重组促卵泡激素优选是哺乳动物的重组促卵泡激素，最优选是重组人促卵泡激素(rhFSH)，该重组人促卵泡激素包括氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的FSHα亚基蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的FSHβ亚基蛋白。在本文中，重组表示通过DNA重组技术获得的，而不是通过从天然来源分离提取的，例如不是从尿液中提取的。

优选本发明第一方面的重组促卵泡激素由如下制备方法制备而得：

(1)将FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因可操作地插入真核表达载体中，获得能表达FSHα亚基蛋白和FSHβ亚基蛋白的转染载体，其中，FSHα亚基基因包含编码FSHα亚基蛋白的cDNA序列和上游内含子序列，FSHβ亚基基因包含编码FSHβ亚基蛋白的外显子2、内含子2和外显子3序列；

(2)将转染载体转染入真核细胞并培养；和

(3)将培养上清液依次经超滤、阴离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、分子排阻层析和阴离子交换层析纯化。

在本文中，可操作地插入表示根据基因序列和载体序列将基因插入载体从而能够进行表达。通常，将基因置于启动子序列和转录终止序列之间并保持阅读框一致。

根据蛋白序列可以推导出大量的基因序列，但是不同基因序列的转录和表达的效率会有很大差异。尽管有基于表达宿主的密码子使用频率的优化手段，但是基因序列的优化仍旧带有很大的经验性。根据本发明人的经验，优选本发明第一方面中，亚基基因序列接近(或优选等于)其天然基因序列，优选FSHα亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，和/或，FSHβ亚基基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。这些基因序列与现有报道的相应基因序列有差异，直接来自天然状态的基因序列，这可能是本发明的rhFSH能够高表达的原因之一。