[发明专利]一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测和鉴定病原微生物制剂领域，特别涉及一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法。

背景技术

德国豪森Harald zur Hausen博士于1983年证实人乳头瘤病毒(HPV)的某些型与宫颈癌有关[1]，并于2008年荣获诺贝尔生理或医学奖。该成果开创了宫颈癌研究的新方向，推动了HPV基因型分析和疫苗的研究和开发，使宫颈癌成为目前唯一一个病因明确、可以预防、早期发现并治愈的人类癌症。2003年国际肿瘤研究机构Nubia Munoz博士等公布了由9个国家11个研究机构的分析报告，根据HPV不同型别与宫颈癌的关系，将被检出的30个HPV基因型分为三大类，其中15种致癌高危型：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82(W13B/MM4亚型和IS39亚型)；3种可能致癌高危型：26，53，66；及12种低危型：6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81(CP8304)和CP6108[2]。从而为HPV基因型分析的方法学研究，提供了可靠依据。此外，还发现高危型与肛门和生殖器癌、口咽癌等有关；低危型与生殖器疣、复发性呼吸道疣状乳头瘤病等有关。

HPV是一类对表皮和黏膜鳞状上皮具有特殊嗜性的小DNA病毒，基因组为双链环状DNA，含有约7900对碱基(bp)。由3个基因区组成，包括早期区(early region，E区)、晚期区(lateregion，L区)区和与非编码区(Uncoding region，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。L区主要有衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，L1高度保守，特异性强；L2编码的衣壳蛋白较小，但变异多。LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控元件，调控病毒的转录与复制。

美国FDA批准四种HPV检测方法：HC II高危HPV检测(Qiagen)，HC II低危HPV检测(Qiagen)；Cervista HPV 16/18检测和Cervista HPV高危检测(Hologics)。HC II是第二代杂交捕获法(Hybrid Capture II)1999年上市，定性区分13种高危型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)与5种低危型(6/11/42/43/44)，但不能分型。Cervista是应用恒温酶DNA扩增和荧光发光判读法，2009年上市，可定性检测14种高危型(增加了66型)，除16/18可以另外检测，也不能具体分型。

中国SFDA批准上市的国产试剂，主要增添了分型功能。基于芯片和流式两种技术：亚能PCR-反向点杂交芯片法，凯普导流杂交低密度基因芯片法和透景Luminex流式荧光杂交法，分别检测23、21和26种型。

此外，采用PCR-质谱联用技术申报专利的方法有密执安州立大学(2006已批准)和深圳华大基因(2008待批准)。前者针对E6基因区进行13种高危型作分型和定量检测，后者采用通用GP5+/GP6+引物针对L1基因区分析17种型。

上述方法存在的问题是：

1.采用PCR技术为基础加杂交或质谱的方法，虽然灵敏度高达10-100个拷贝。但是均未排除因PCR扩增产物污染，引起的假阳性问题。

2.目前检测HPV的基因区均采用单个目标基因探针，多数为L1区，密执安大学为E6区。而临床标本由于病毒在整合时容易发生目标片段(L1，E1，E2，E6，E7)的缺失或变异，且HPV不同类型，在不同肿瘤和组织中，在潜伏期和活动期的E和L基因的拷贝数也不同，而易造成检测漏诊。也是导致目前采用不同方法，在检测同一样本中HPV类型时，获得结果不一致，造成假阴性问题的主要原因(数据待发表)。

3.检测的HPV型别种类，均未能达到2003年国际肿瘤研究机构提出的30种致病型的要求，其检测结果将使＞1％的人检测漏诊。[2]