[发明专利]一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法

权利要求书

1.一种检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法，所述HPV基因型，包括HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、82和89型，每种基因型采用双探针检测，包括一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区，所述方法包括以下步骤：

(1)用一对PCR引物，在引物的5’端带有ACGTTGGATG碱基的任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，以区别于探针；在扩增区域中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基；

(2)第一次PCR扩增反应，将dUTP/dATP/dGTP/dCTP混合物、UNG酶、Tag酶和多重PCR引物一同加入PCR反应体系中，先进行dUTP的消化，降解PCR扩增产物，然后灭活UNG酶，随后作45个循环PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物；

(3)用虾碱性磷酸酶处理，使第一轮反应中剩余dNTP脱磷酸失活；

(4)第二次单碱基延伸扩增，将ddNTPs或类似核酸末端终止剂加入反应体系中，使之在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，扩增200个循环，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少20Da；

(5)采用阳离子交换树脂吸附盐离子，纯化延伸反应产物；

(6)纯化后产物采用质谱技术进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因的类型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中每一种待测HPV基因同时采用两个或两个以上基因区检测，其中一种致癌性早期转录区E6或E7基因区和一种衣壳蛋白晚期转录区L1或L2基因区。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)第一次扩增包括至少一组相匹配的所述HPV基因型的正向和反向引物序列选自表1中的序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.120。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)第二次单碱基延伸扩增包括至少一种碱基延伸探针选自表2中的序列SEQ ID NO.121-SEQ ID NO.180。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用β球蛋白基因作为样品DNA提取质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.181和SEQ ID NO.182，探针序列为SEQ IDNO.183。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用典型模式植物拟南芥基因作为PCR反应质量控制参照，引物序列为SEQ ID NO.183和SEQ ID NO.184，探针序列为SEQ ID NO.185。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在每次反应中加入阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为去离子双蒸水；阳性对照为β球蛋白基因和植物拟南芥的重组质粒cDNA。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定步骤检测浓度可低至1拷贝/反应。

9.一种检测生物样品中病原体DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含一种或多种如权利要求3、4、5和6所述的合成的多核苷酸试剂。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，测定步骤如下：

待检测HPV基因型包括HPV类型6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81/CP8304、82、CP6108和/或89型中的一种或几种，每种基因型同时采用包括但不限于两个或两个以上基因检测，包括如下步骤：

(1)根据待测HPV基因型全序列，获取E6和E7基因区，以及L1和L2基因区，选择每个型别的特异性保守序列，设计一对PCR引物，在引物的5’端带有10个碱基(ACGTTGGATG)任意组合的标签序列，使总长度达到30个碱基以上，用以从分子量上将引物与探针区别开。各种HPV基因型的扩增引物序列见表1。在扩增区中的保守序列区设计一条单碱基延伸探针，探针的长度为14-28个碱基，在探针的3’末端，允许延伸一个经设计确定的碱基，作为该基因型特异性序列标记，单碱基延伸后总长度不超过29个碱基，每个探针的延伸产物之间分子量相差至少16Da，各种HPV扩增引物序列见表1，其对应的碱基延伸探针见表2，

(2)通过PCR扩增，获得待测样本中靶序列扩增产物，

PCR反应体系配制见表3.

先用37℃-50℃ 2分钟，进行dUTP的消化，然后94℃ 4分钟灭活，(同时这一步也达到预变性的效果)，随后作PCR扩增。反应条件为95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共45个循环；最终72℃延伸5分钟，完成后恒温于4℃，

(3)通过虾碱性磷酸酶(SAP)处理，使未结合的剩余核酸(dNTPs)脱磷酸失活，预防干扰下一步碱基延伸反应。SAP消化酶反应体系见表4，反应条件为37℃孵育40分钟，去除剩余dNTPs；然后用85℃5分钟使SAP酶失活，

(4)通过碱基延伸反应，在单碱基延伸探针的3’端，延伸一个序列特异性单核苷酸，作分子量标记，得到的延伸产物与所述延伸探针及各型别延伸产物之间的分子量差异不小于16Da，延伸反应体系见表5，延伸反应探针mix的浓度，按照各型分子量大小进行线性关系调节，总浓度约为8-15M，最终浓度约为0.84-1.57M，循环反应为200个短阶梯程序，包含两个循环嵌合，开始为94℃变性30秒，随后在94℃ 5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共40个循环中，每个插入退火和延伸5个小循环；最终72℃延伸3分钟，

(5)采用树脂脱盐纯化延伸反应产物，

(6)将纯化后产物采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱系统进行分子量检测，根据分子量标记确定待测HPV基因型别，图1-31中，横坐标为分子量，纵坐标为峰强度，图中纵行虚线同色为该基因型延伸探针的分子量位置，如果不存在该型别探针峰不变；如果被检出型别拷贝数大于10，探针可被完全消耗，左侧峰消失转至右侧；右侧的同色虚线表示延伸产物分子量位置，用TYPE4.0软件阅读谱图，自动分析和报告结果，导出数据，数据解释为，每一型HPV和内参HBB的延伸探针在质谱图不同的质量处有相应分子量峰，在探针发现目标基因工作时出现单碱基延伸产物，探针分子量峰发生转移为产物分子量峰，分析结果报告为阳性。阳性结果分为四种：A、结果可靠；B、中度可靠；C、一般可靠；D、低度可靠，前三种视为延伸反应有效，有相应HPV感染，第四种需要人工辅助判断，观察探针是否消耗，判断为可疑感染或阴性结果。