[发明专利]一种新型免疫调节蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因重组及表达的促Treg活化蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(CD4⁺CD25⁺regulatory T cells，Tregs)是在研究自身免疫性疾病时发现的一类特殊的CD4+T淋巴细胞亚群，表达CD25、CTLA-4、GITR、CD86和特征性的转录因子FoxP3，对维持和调节人体免疫平衡有重要作用。Tregs具有持久的免疫抑制活性。Tregs可识别自身抗原和外来抗原，非特异性抑制其它免疫相关细胞活性，抑制不适当或过度的免疫反应，调节和维持免疫稳态，诱导免疫耐受。Tregs的特殊生物学功能，为临床治疗自身免疫性疾病和移植免疫相关疾病提供了新的思路。根据细胞发育过程、抗原特异性、活化机制和信号通路，Tregs分为天然型Treg细胞(nTregs)和诱生型Treg细胞(iTregs)。天然Tregs占全部CD4⁺细胞的5％-10％，在外周血不到2％，且只有CD4⁺CD25^brigh+high orCD4⁺CD25⁺Fox3⁺T细胞才为具有免疫抑制的Tregs。因此，如何获得足够数量的有功能的Tregs成为其临床应用的瓶颈。尝试诱发或扩大Tregs的调节功能主要有两种途径：分离有适应症患者Tregs在体外扩增后回输和利用相关媒介在体内增强Tregs功能。后一方法需要一种生物制剂。

寻求能在体内活化Tregs增强其抑制功能且无毒副作用的生物制剂成为研究的热点。Jiaxiang(an additional[J].Int Immunol，2009，21(3)：283-294)等分离健康人外周血CD4+CD25+T细胞使其感染人类免疫缺陷病毒1(HIV-I)并检测Treg相关功能标记物，研究发现，静止的CD4⁺CD25⁺T细胞感染有活性或灭活的HIV-1后，Treg特征性标记Fox3表达量增多，CD4⁺CD25⁺T细胞的抑制功能增强了2～5倍，且上调抗凋亡分子Bcl-2延长细胞生存，表达归巢受体CD62L和α4β7，诱导CD4⁺CD25⁺T在外周淋巴结和粘膜相关淋巴组织聚集。HIV引起的静止CD4⁺CD25⁺T的生物学行为改变引起了人们的关注。HIV主要通过其包膜蛋白gp120与CD4⁺T细胞表面CD4分子结合入侵人体。Christian Becker(Blood，2009，114(6)：1263-1269)等发现真核表达获得的可溶性重组gp120分子能够与CD4分子结合上调CD4⁺CD25⁺T细胞内cAMP，增强其抑制功能，单剂量输注5μg gp120输入小鼠体内，足以能够保护小鼠免死于致死性的移植物抗宿主病，说明游离的gp120分子在体内外均与CD4分子结合，增强CD4⁺CD25⁺T细胞的抑制功能，可能为一种潜在的生物制剂。

外膜蛋白gp120由恒定区和高变区组成：V1～V5区段为高变区，位于gp120表面，C1～C5区为稳定区，主要位于gp120核心区域。gp120的第4恒定区(C4)与CD4的MHC II分子结合部位结合，引起gp120的构象改变，在其第3高变区(V3)发生蛋白水解，并通过细胞表面融合受体(fusion receptor)与跨膜蛋白gp41融合，使gp41暴露，从而使疏水性较强的gp41一端插入靶细胞胞膜中，便于病毒胞膜与靶细胞膜融合，完成HIV侵入CD4⁺靶细胞。C4区是gp120与CD4结合的主要区域，V3区对HIV侵入有重要的辅助作用，此外，gp120的第2恒定区(C2)、第3恒定区(C3)和第4高变区(V4)也有一定的辅助作用。Ogert RA等研究发现HIV gp120全长在大肠杆菌中很难得到表达，通过同源基因重组技术克隆对AIDS治疗药物vicriviroc有抗性HIV gp120的C2-V5区，证实C2-V5区与gp120全长有同样的生物学活性，对vicriviroc有100％的抗性。可见C2-V5区是gp120活性中心。

发明内容