[发明专利]一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法。

背景技术

根际微生物(rhizosphere microbe)是在植物根系直接影响的土壤范围内生长繁殖的微生物，其种类有细菌、放线菌、真菌、藻类和原生动物等，一般数量比根际外多几倍至几十倍。它们和植物间是互生关系，与植物根系相互作用、相互促进。根据植物根系与根际微生物共存形式又分为多种形式，最常见的如豆科植物与相应的根瘤细菌、外生菌根、内生菌根以及病原菌复合体等。

近年来，随着宏基因组学与分子生态技术迅速发展，微生物荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)结合的显微镜观测成为了解根际微生物的有力工具。荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。它以荧光染料标记的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作为探针，按照两个核酸的碱基序列互补原则，将荧光素标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上(也可使用生物素标记的探针，再加入标记有荧光素的生物素单抗)，通过荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列进行定位、定性和相对定量分析，实现原位样品中的目标细菌的探测。

荧光原位杂交技术已经开始应用于植物根际微生物的观察，但是目前普遍存在一些难点问题，主要集中在两个方面。第一个方面也是最大的一个难点是植物根系本身通常具有较强的自发荧光。植物样本采集后的最初24小时之内是观测的最佳时机，之后由于植物本身逐渐加强的自发荧光现象严重干扰了微生物的观测，但现实操作中很难保证采集植物样本后能够及时进行检测。第二个方面是根际微生物稀疏的分布使得显微镜观测过程中难以寻找到目的微生物，并且随着时间的推移，根系本身逐渐加强的自发荧光现象使观测更加困难。这两个难点为植物根际微生物FISH观测的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法。

本发明提供的用于检测植物根际微生物的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

(1)植物根系片段的固定；

(2)荧光原位杂交；

其特征在于：所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括如下步骤甲：将完成步骤(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四钠水溶液进行处理，然后弃去所述植物根系片段。

所述步骤甲中的处理条件可为：20-30℃、15-60分钟。所述步骤甲中的处理条件具体可为22℃、20分钟。所述步骤甲中，所述焦磷酸四钠水溶液的浓度具体可为0.001mol/L。

所述方法还可包括如下步骤乙：将完成所述步骤甲的溶液体系(反应习题)离心收集沉淀，用PBS缓冲液冲洗并悬浮。所述PBS缓冲液具体可为pH＝7.4、10mmol的PBS缓冲液。每株植物的根系片段完成所述步骤甲的溶液体系得到的沉淀优选采用2-5ml所述PBS缓冲液进行所述悬浮。所述两步骤乙中的所述离心的条件具体可为16000g，30秒。

所述步骤(1)具体可为：将所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小时；所述溶液甲是将3体积份固定液和1体积份3×PBS缓冲液混合得到的；所述固定液的pH为7.0-7.4，含有4g/100ml多聚甲醛。所述固定液的配制方法具体如下(以100ml体积为例)：(1)取66ml超纯水在水浴中加热至60℃；(2)加入4g多聚甲醛；(3)加入2mol/L的NaOH水溶液至多聚甲醛充分溶解；(4)用3×PBS缓冲液补足至100ml；(5)室温下放置冷却，用lmol/L的HCl水溶液调节pH至7.0-7.4；(6)用注射器通过滤头(0.22μm)过滤。所述3×PBS缓冲液具体可为pH＝7.4、30mmol的PBS缓冲液。

所述荧光原位杂交的条件具体可为：46℃杂交1.5小时。

所述荧光原位杂交所用的探针上具有荧光素标记。所述荧光素具体可为FLUOS荧光素。所述荧光原位杂交所用的探针的核苷酸序列具体可如序列表的序列1所示。所述荧光素可位于所述探针的5’端或3’端。在所述荧光原位杂交中，所述探针的浓度优选为8.3pmol/μl或5pmol/μl。所述植物根际微生物具体可为真细菌。

所述植物具体可为灯芯草(Juncus acutiflorus)。

本发明提供的方法具体可包括如下步骤：

①将植物的根系组织切割成1.5-2.5cm(2cm左右)长度的根系片段；