[发明专利]β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用。

【背景技术】

β-1，3(4)-葡聚糖内切酶(Endo-β-1，3(4)-glucanase，EGase，以下简称“β-葡聚糖内切酶”，酶学分类号为EC3.2.1.73)是一类能偶特异性的水解β-1，3(4)-葡聚糖中与β-1，3糖苷键毗邻的β-1，4糖苷键的糖苷水解酶(glycosylhydrolases，GH)，水解产物通常为3～5个寡糖^[1]。

大麦芽是啤酒生产的主要原料，大麦胚乳细胞壁约70％的组分为β-1，3(4)-葡聚糖^[2]。在啤酒酿造过程中，糖化过程变性的蛋白质会与过量的β-1，3(4)-葡聚糖结合会造成酵母早期沉积，从而影响发酵，并导致啤酒酿造过程中的双乙酰还原期延长；过量的β-1，3(4)-葡聚糖还会引起啤酒浑浊和沉淀，影响啤酒的品质。因此，啤酒在原料糖化后，要添加适量的β-葡聚糖内切酶以水解原料中的β-1，3(4)-葡聚糖。麦片因纤维含量高、营养价值高成为老年人喜爱的食品，但食用过量的麦片容易引起老年人消化不良，因此，在麦片中添加适量的β-葡聚糖内切酶或食用麦片后再食用几片含β-葡聚糖内切酶的多酶片可以有助于消化。玉米胚乳细胞壁中也含大量β-1，3(4)-葡聚糖，崽猪食用以玉米为主要原料的饲料时容易引起消化不良。因此，在饲料中添加适量的β-葡聚糖内切酶，让崽猪及早食用可消化的饲料，可以让崽猪及早断奶，从而提高生猪的生产效率。

植物、真菌和细菌都含有β-葡聚糖内切酶，植物β-葡聚糖内切酶属于糖苷水解酶的GH17家族，而微生物β-葡聚糖内切酶则属于糖苷水解酶的GH16家族。尽管GH16和GH17家族的β-葡聚糖内切酶有相似的功能，但他们在结构上却没有相似性，GH17家族成员的三级结构呈(β/α)₈桶状^[3]，而GH16家族成员的三级结构则呈β-三明治折叠卷状^[4]。大麦β-葡聚糖内切酶在种子萌芽早期表达量最高，其最适pH值(pH_opt)为4.6、最适温度(T_opt)为45℃^[5，6]。芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶也能特异水解大麦β-1，3(4)-葡聚糖，其pH_opt介于6.0～7.5、T_opt介于58℃～60℃^[7-13]，但该类β-葡聚糖内切酶大多对酸环境敏感^[1]。浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶是最耐热的β-葡聚糖内切酶之一，T_opt为65℃，在75℃时还有80％的活性，pH_opt为中性。淀粉液化芽孢杆菌的β-葡聚糖内切酶的pH_opt为6.0，受酸性环境影响最小^[14]。用淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸替换浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸组合成的杂合酶H(A16-M)在80℃时还有80％的活性，对酸性环境耐受能力有所提高，对大麦β-1，3(4)-葡聚糖的特异性还比野生型浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶还高40％^[15]，但国内没有该类酶的知识产权，啤酒行业使用的β-葡聚糖内切酶目前主要依赖进口。真菌β-葡聚糖内切酶水解的底物比大麦和芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶广泛，不仅能水解大麦β-1，3(4)-葡聚糖，还能水解羧甲基纤维素和昆布多糖^[16-19]。尽管国内在芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶和真菌β-葡聚糖内切酶上也有一定的研究^{[11-13，19，20]}，但能替代进口产品的β-葡聚糖内切酶还没有出现。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种能够表达具有β-葡聚糖内切酶活性的蛋白的β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因，并提供其表达产物及应用。

一种β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因，包括如下序列：

(a)、编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(b)、和编码由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；

(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖内切酶活性；或