[发明专利]一种新奥苷肽粉状固体的制备方法

说明书

所属领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种新奥苷肽的提取方法，特别是一种从发酵液中分离提取新奥苷肽的方法。

背景技术

近年来，我国研究开发了一系列的核苷类农用抗生素。如，具有胞苷骨架的核苷类抗生素武夷霉素，嘧肽霉素，多抗菌素(polyoxin)，含有胞嘧啶核苷肽类结构的宁南霉素、云南霉素及庆丰霉素等。以上核苷类农用抗生素均为通过微生物发酵产生，而微生物菌株发酵产生的核苷类活性物质的量往往很低，加之在发酵液中还有与核苷类活性物质共存的其它大量杂质和副产物，如有微生物细胞、蛋白质、色素、其它细胞代谢产物及末用完的培养基等，从发酵液中提取分离核苷类活性物质也是一个比较复杂的过程。目前，源自微生物发酵产生的核苷类农用抗生素的提取主要有两种提取方法，一种是离子交换方法，包括发酵液的酸化，固液分离，离子交换层析，浓缩等；另一种方法是膜提取方法，通过采用微滤膜微滤，再超滤，纳滤和喷雾干燥等。

本实验室在进行抗生素的研究过程中，发现一株放线菌经发酵能产生具有广谱抗菌生物活性的嘧啶核苷肽类物质，尤其对革兰氏阳性菌、植物病毒的抑制活性很强，如有很强的抗植物病毒病如烟草、辣椒、番茄花叶病毒病等的活性。发明者命名该放线菌产生的嘧啶核苷肽类抗菌物质为新奥甘肽(或新奥霉素)，主要成分是一种新的尿嘧啶核苷肽(1-尿嘧啶-4肌氨酰-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸)(专利申请号：200910060121.4)，化学结构为：

目前已公开的新奥苷肽提取技术内容(专利申请号：200910060121.4)主要涉及微量新奥苷肽样品(mg级)的制备技术，包括新奥苷肽发酵结束后，通过添加2-4倍发酵液体积的甲醇或乙醇，从上述发酵培养液中收集新奥苷肽，再通过正相硅胶层析和反相硅胶层析分离，得到的新奥苷肽样品，用高效液相色谱进一步分离纯化，制备得到微量的新奥苷肽。该提取技术方法步骤繁琐，耗用大量的有机溶剂，提取周期长，活性损失大，不适合大量新奥苷肽的制备。如果通过传统的离子交换方法提取新奥苷肽，得到的是膏状的产品；而用膜技术提取，一次性设备投资非常大。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种从发酵液中分离提取新奥苷肽的新方法，实现高纯度新奥苷肽粉状固体的大量制备。本发明包含以下步骤：发酵液，灭菌，预处理，减压浓缩，柱层析，减压浓缩，干燥，新奥苷肽粉状产品。

上述步骤中的发酵液是由能产生新奥苷肽的放线菌或其遗传改良菌株，通过在一级液体培养基中培养，作为种子液；将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到适合放线菌或其遗传改良菌株生长和产生新奥苷肽的培养基中培养，在26℃-37℃发酵培养2-5天，发酵结束后，收集发酵液；

上述步骤中的发酵液先加热升温至60℃，保持10-60分钟，杀灭发酵液中的放线菌或其遗传改良菌株活菌体，然后将发酵液温度降至30℃以下；

上述步骤中的预处理操作是加0.1％-3.0％(克/毫升)的助滤剂到灭菌发酵液中，充分搅拌，放置10-30分钟，加入0.01％-0.1％(克/毫升)的絮凝剂，充分搅拌，用型号为600-2000目的滤布进行过滤，除去菌体、细胞碎片及其它蛋白质等固形物。

所述的助滤剂可以为：活性碳、珍珠岩、高岭土或硅藻土；

所述的絮凝剂可以为：明矾、聚氯化铝或三价铁的盐类；

上述步骤中预处理的发酵液，经过滤后，在真空度-0.08MPa至-0.09Mpa，水浴温度60～70℃或50～55℃；所得粗膏与柱层析硅胶(100～200目)混合，其比例为粗膏∶硅胶＝1∶1～2.5，搅拌均匀，在40℃条件下真空干燥，磨碎，过100目筛。用G100～200的硅胶填柱，其质量是上柱搅拌物料的5～10倍，进行硅胶柱层析，采用氯仿∶甲醇＝80～20∶20～80二元洗脱剂进行梯度洗脱，下柱液以薄层层析分析结果分段采集，减压下蒸馏回收洗脱溶剂，浓缩物经干燥得到新奥苷肽粉状产品。

本发明将专利200910060121.4公开的新奥苷肽的提取方法中的硅胶层析三元洗脱体系改变为二元洗脱体系，并去掉了反相硅胶层析分离和高效液相色谱纯化步骤，具有使用有机溶剂耗用少，获得的新奥苷肽产品纯度高，易于工业化等优点。

附图说明

新奥苷肽粉状产品生产的工艺流程图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1