[发明专利]缺血模型多模态分子成像监测方法

说明书

一、技术领域：

本发明涉及到多模态分子成像技术领域，具体涉及一种缺血模型多模态分

子成像监测方法。

二、背景技术：

近年来，基于缺血型的小动物分子成像技术受到了广泛关注，针对这一动物模型应用干细胞介导的缺血损伤修复和血管新生的研究已屡见不鲜。然而，对动物模型的干预效果监测手段目前主要有离体的免疫组化、免疫荧光等手段，对于干细胞在小动物体内的存活情况则需要通过移植来源于带有绿色荧光蛋白(GFP)的转基因动物的干细胞到损伤动物模型，干细胞的存活情况需要处死动物后获取组织在显微镜下观察绿色荧光蛋白来进行鉴定（Katstural Jetal, Circulation Research, 2005），在体观察干细胞也有文献报道采用生物发光成像（Bioluminescence imaging, BLI）技术对表达荧光素酶（luciferase）的干细胞进行观测（Cao, F. et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation 113, 1005-1014,2006）；生物发光成像技术只能获取二维的平面像，不能直观地显示小动物体内光源所处的三维空间位置信息，在可视化效果上有很大的局限性；在定量分析方面，生物发光成像只能进行相对的定量分析，不具有绝对定量的意义，可以参见：R. Weissleder and M. J. Pittet, Imaging in the era of molecular oncology, Nature 452, 580-589 (2008). 另外，对小动物缺血模型还需要观察干细胞干预后的血管新生情况，传统的方法是取缺血区域的组织对血管内皮的标志分子CD31进行抗体染色，通过对照组和干预组比较血管新生的情况。这种方法需要在不同的阶段处死动物模型，给实验的连续观测带来了很大的不便。

三、发明内容：

本发明针对上述现有技术方法中对小动物缺血模型的干细胞干预过程中干细胞的存活和定位示踪、以及血管新生的离体观测方法的缺陷，提供一种缺血模型多模态分子成像监测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：所述的监测步骤为：

（1）稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的干细胞的分离和培养；

（2）构建缺血动物模型；

（3）移植步骤（1）中的培养的干细胞到步骤（2）所构建的动物模型的缺血损伤区域；

（4）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用生物发光断层成像系统进行成像，观测时间点直到看不到发光的干细胞为止；从而可以定位干细胞在小动物体内存在的三维空间位置和示踪干细胞的存活情况，通过干细胞定量方法观测干细胞在体内不同时间点的存活数量；

（5）通过稳定表达绿色荧光蛋白的干细胞进行抗绿色荧光蛋白的抗体染色，处死动物模型并在注射干细胞的区域取肌肉组织制作冰冻切片，用荧光显微镜观察标记绿色荧光蛋白的干细胞来做干细胞在缺血组织中的存在性验证；

（6）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系统对动物缺血模型的微血管网络成像，观测微血管网络密度是否发生了变化；

（7） 由小动物缺血模型和干细胞移植后的不同时间点的干预组和对照组的血管铸型、血管铸型的电镜扫描结果来验证micro-CT对微血管网络密度变化的成像结果以及验证血管是否有发芽情况。

在步骤（1）中的干细胞是由稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的转基因动物分离出来的，通过稳定表达荧光素酶在底物荧光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在动物体内产生生物发光，并采用光学分子成像设备探测到生物发光穿透生物组织，通过光信号的强度确定荧光素酶标记的干细胞的分布密度或干细胞的数量。

在步骤（2）中成功建立小动物缺血模型，结扎动脉的中间部位，保证有微弱的侧枝循环，要保证缺血的效果既不能使缺血区域坏死，又要保证多只动物缺血模型的一致性。

在步骤（3）将脂肪来源的间充质干细胞多点肌肉注射到缺血损伤区域，注射的多点个数为3-5个，注射点距离血管结扎部位1-3mm。