[发明专利]缺血模型多模态分子成像监测方法

权利要求书

1.缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：所述的监测步骤为：

（1）稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的干细胞的分离和培养；

（2）构建缺血动物模型；

（3）移植步骤（1）中培养的干细胞到步骤（2）所构建的动物模型的缺血损伤区域；

（4）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用生物发光断层成像系统进行成像，观测时间点直到看不到发光的干细胞为止；从而可以定位干细胞在小动物体内存在的三维空间位置和示踪干细胞的存活情况，通过干细胞定量方法观测干细胞在体内不同时间点的存活数量；

（5）通过稳定表达绿色荧光蛋白的干细胞进行抗绿色荧光蛋白的抗体染色，处死动物模型并在注射干细胞的区域取肌肉组织制作冰冻切片，用荧光显微镜做干细胞在缺血组织中的存在性验证；

（6）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系统对动物缺血模型的微血管网络成像，观测微血管网络密度是否发生了变化；

（7）由小动物缺血模型和干细胞移植后的不同时间点的干预组和对照组的血管铸型以及血管铸型的电镜扫描结果来验证micro-CT对微血管网络密度变化的成像结果。

2.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：在步骤（1）中的干细胞是由稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的转基因动物分离出来的，通过稳定表达荧光素酶在底物荧光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在动物体内产生生物发光，并采用光学分子成像设备探测到生物发光穿透生物组织，通过光信号的强度确定荧光素酶标记的干细胞的分布密度或干细胞的数量。

3.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：在步骤（2）中成功建立小动物缺血模型，结扎小动物目标区域动脉的中间部位，并且有微弱的侧枝循环以保证缺血的效果既不能使缺血区域坏死，又要保持多只动物缺血模型的一致性。

4.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：所述的移植干细胞到所构建的动物模型缺血损伤区域，将脂肪来源的间充质干细胞多点肌肉注射到缺血损伤区域，注射的多点个数为3-5个，注射点距离血管结扎部位1-3mm。

5.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：在步骤（4）中利用生物发光断层成像系统对动物缺血模型中移植的干细胞进行示踪、观测存活情况，首先，在成像前10分钟对缺血动物模型注射荧光素底物每千克体重注射荧光素底物150 mg 至450mg，浓度为150 ug/ml 至450ug/ml，然后，将小动物放置到生物发光断层成像系统的支架上，用装有异氟烷的动物麻醉机通过气体麻醉，并密闭暗箱，调节系统的成像参数，曝光时间设置为3至10分钟、根据生物发光信号的强度设置科学级CCD相机的光圈范围为1至8，采集图像的binning值设置为4或者8，间隔90度拍摄小动物体表的4个位置的生物发光信号，并在动物体表间隔90度放置直径为1mm的尼龙球作为标志物，并同样用CCD相机采集四个位置的照片，用于生物发光断层成像系统与micro-CT系统的双模态配准融合，对于缺血模型还要通过与生物发光断层成像系统垂直安装的micro-CT系统获得缺血模型的解剖结构信息；对这些解剖结构信息赋予光学参数后，进行生物发光信号的体内光源重建；设置micro-CT系统的X-ray球管电压为50kVp、电流为0.95mA、积分时间为0.5秒、采用外触发模式、间隔0.6度或0.75度采集一幅图像，对动物采集360帧或480帧图像，采集完图像后将动物和附着在动物体表的标记点取下，通过micro-CT采集180帧钢珠几何仿体、暗电流以及空扫数据，用于动物的micro-CT的校准和三维重建；从而得到动物模型的三维解剖结构信息，micro-CT重建后的解剖结构信息与前面采集的四个位置的生物发光信号相结合即可以重建得到稳定表达荧光素酶的干细胞发光的三维空间位置和光源能量的定量信息。

6.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于：对步骤（5）中的干细胞在缺血组织中的存在情况进行验证，通过处死缺血模型取缺血区域的肌肉组织，制作冰冻切片并用抗绿色荧光蛋白抗体染色，通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察染色后的冰冻切片来证明干细胞在缺血组织中的存在。