[发明专利]一种提供多种细胞协同生长的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提供多种细胞协同生长的方法，还涉及与该方法相关的制备材料和制备工艺。

背景技术

随着细胞生物学的发展，人们越来越认识到不同种类细胞间相互作用的重要性。而细胞间相互作用的研究包含了几个方面：细胞间直接接触产生生物学效应；细胞间通过细胞外基质产生生物学效应；细胞间通过化学信号配体、受体产生生物学效应等。而目前对上述效应的研究和应用都是在开放体系，细胞间直接接触共培养的情况下进行。这种方法的最大缺点就是难以区别细胞间相互作用的产生是由于直接接触效应还是单纯的化学信号传导效应，且不同种类细胞不易分离，无法考察相互作用后单种细胞产生的生物学效应。针对此问题，有研究者发明了Transwell insert技术[参考文献：Le Visage，C；Dunham，B；Flint，P，et al..Coculture of mesenchymal stem cells and respiratory epithelial cells to engineer a human composite respiratory mucosa，Tissue Engineering，2004，10：1426-1435]，实现细胞分层培养，互不接触，仅通过培养液实现信号传导，分析细胞间的相互作用。但该技术的最大缺陷是无法提供细胞模拟在体的三维环境，应用时无法实现规模放大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的实现多种细胞协同生长的方法，是将生理条件下制备的水凝胶载体，以大载体中包埋小载体的方式，在不同载体中培养不同种类的细胞，通过控制小载体膜孔隙的截留分子量、表面电荷、粗糙度等参数，提供研究细胞间化学信号传递和相互作用的方法。该方法的结构示意图见附图1。该方法与“生物人工反应装置中的两步微囊制备方法”[专利申请号200910029377.9]最大的区别在于大载体不具有半透膜结构，由此可采用不同方法破碎大载体和小载体，从而实现分别回收不同载体中的不同细胞，有利于下游实验的操作，使得该方法可用于细胞间相互作用的研究。

本发明提供的方法可用于研究存在于两种不同细胞间的相互作用，如子宫内膜基质细胞可调控上皮细胞的增殖和分化，软骨细胞可诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，激活的小胶质细胞可调控神经元的存活；也可用于研究存在于多种细胞间的相互作用，如树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞可杀伤肿瘤细胞，肿瘤细胞和肌成纤维细胞可促进血管内皮细胞活化；也可用于研究存在于细胞和组织间的相互作用，如骨髓间充质干细胞可保护胰岛的功能和活性，椎间盘可诱导骨髓间充质干细胞向椎间盘样细胞分化。

为实现上述目的，本发明的制备方法和工艺流程如下：

1)将细胞a均匀分散到10-40g/L海藻酸钠溶液中，在0.01-1.0mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴或以0.05-0.1mol/L碳酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙颗粒为分散相的条件下，制备出包埋有细胞a的海藻酸钙微球，再与pH4-6的1-8g/L壳聚糖或0.2-1g/L聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸中的一种溶液反应成膜，制备出包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊；

也可以在步骤1之后，用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体A内部液化，制备出内部为液体环境的包埋有细胞a的海藻酸钠微胶囊；

2)将包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊和细胞b共同均匀分散到10-40g/L海藻酸钠溶液中，在0.01-1.0mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴或以0.05-0.1mol/L碳酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙颗粒为分散相的条件下，制备出包埋有含细胞a的海藻酸钙微胶囊和细胞b的海藻酸钙微球；

3)经过培养后，当需要回收细胞时，用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体B液化，释放载体B中的细胞b，经过过滤，细胞b与包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊分离，离心收集细胞b。再通过用机械方法如研磨或化学方法如“一种在生理条件下溶解载细胞微胶囊的方法及配方”[专利申请号02127631.5]中提供的方法进行包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊的破碎，释放出包埋的细胞a，离心收集细胞a。