[发明专利]一种提供多种细胞协同生长的方法

权利要求书

1.一种提供多种细胞协同生长的方法，其特征在于：

1)首先制备包埋有细胞a的水凝胶载体A；再将包埋有细胞a的水凝胶载体A与聚阳离子高分子溶液反应成膜；

2)再将包膜的水凝胶载体A与另一种细胞b共同分散到水凝胶制备材料中，制备出包埋有包膜的载体A和细胞b的水凝胶载体B，两种载体在空间形成了细胞a、b的非直接接触效应；

3)其中，细胞a或b分别可以为一种或二种以上不同种类的细胞或组织；细胞a和细胞b之间通过非直接接触效应协同生长，细胞a或b可以影响细胞b或a的增殖、凋亡、分化、细胞外泌功能中的一种或多种。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

细胞a或b分别为一种或二种以上不同种类的细胞或组织；所述细胞a和b为具有可通过细胞a、b非直接接触方式由化学信号传递进行相互作用的细胞组合；所述相互作用是指细胞a或b可以影响细胞b或a的增殖、凋亡、分化、细胞外泌功能中的一种或多种。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

细胞a和b可以为不同的细胞或组织，分别对应于下述细胞的不同组合：子宫内膜基质细胞和上皮细胞，软骨细胞和骨髓间充质干细胞，小胶质细胞和神经元，树突状细胞与杀伤细胞、和肿瘤细胞，肿瘤细胞与肌成纤维细胞、和血管内皮细胞，骨髓间充质干细胞和胰岛，椎间盘和骨髓间充质干细胞。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

载体A与载体B分别是以海藻酸钠为水凝胶材料，载体A制备成微胶囊，载体B制备成微球；两种载体的空间分布是微球内包含微胶囊，微球粒径大于微胶囊粒径；

微胶囊具有半透膜结构，膜孔隙大小由载体A和聚阳离子高分子材料的浓度决定，其截留分子量在60KDa-200KDa可控。

5.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

聚阳离子高分子溶液为pH4-6的1-8g/L壳聚糖或0.2-1g/L聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸中的一种。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

制备载体A的水凝胶材料为海藻酸钠，采用静电液滴法、气动液滴法、乳化-内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化、乳化-外部凝胶化或膜乳化/外部凝胶化方法制备出海藻酸钙微球，再采用壳聚糖、聚赖氨酸、聚精氨酸或聚鸟氨酸包膜制备出海藻酸钙微胶囊；

载制备体B的水凝胶材料为海藻酸钠，采用静电液滴法、气动液滴法、乳化-内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化、乳化-外部凝胶化或膜乳化/外部凝胶化方法制备出海藻酸钙微球。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：

包膜后的载体A制备后也可用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体A内部液化，制备出内部为液体环境的包埋有细胞a的海藻酸钠微胶囊。

8.按照权利要求1或5所述的方法，其特征在于：

经过培养后，载体A和载体B内的细胞a和细胞b可分别收集；载体A和载体B破碎解离的方法不同；

首先用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体B液化，释放载体B中的细胞b，经过过滤，细胞b与包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊分离，离心收集细胞b；

再通过机械方法或化学方法破碎包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊，释放出包埋的细胞a，离心收集细胞a，从而实现细胞间发生相互作用后的分别获得，分别考察不同细胞的生物学效应。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

该技术的制备步骤如下：

1)将细胞a均匀分散到10-40g/L海藻酸钠溶液中，在0.01-1.0mol/L的CaCl2溶液作为凝胶浴或以0.05-0.1mol/L碳酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙颗粒为分散相的条件下，采用静电液滴法、气动液滴法、乳化-内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化、乳化-外部凝胶化或膜乳化/外部凝胶化方法制备出包埋有细胞a的海藻酸钙微球，再与pH4-6的1-8g/L壳聚糖溶液或0.2-1g/L聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸中的一种溶液反应成膜，制备出包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊；

也可在步骤1)之后，用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体A内部液化，制备出内部为液体环境的包埋有细胞a的海藻酸钠微胶囊；

2)将包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊和细胞b共同均匀分散到10-40g/L海藻酸钠溶液中，在0.01-1.0mol/L的CaCl₂溶液作为凝胶浴或以0.05-0.1mol/L碳酸钙、柠檬酸钙、乳酸钙颗粒为分散相的条件下，采用静电液滴法、气动液滴法、乳化-内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化、乳化-外部凝胶化或膜乳化/外部凝胶化方法制备出包埋有含细胞a的海藻酸钙微胶囊和细胞b的海藻酸钙微球；

3)经过培养后，当需要回收细胞时，首先用钙离子螯合剂20-80mmol/L柠檬酸钠或0.5-10mmol/L EDTA使水凝胶载体B液化，释放载体B中的细胞b，经过过滤，细胞b与包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊分离，离心收集细胞b；

再通过用机械方法或化学方法进行包埋有细胞a的海藻酸钙微胶囊的破碎，释放出包埋的细胞a，离心收集细胞a。