[发明专利]防治棉花枯黄萎病的合剂

权利要求书

1.一种防治棉花枯、黄萎病的生防复合菌剂BB1623，含两种细菌成分：分别是短小芽孢杆菌CS23（Bacillus pumilus）和枯草芽孢杆菌SM16（Bacillus subtilis），短小芽孢杆菌CS23（Bacillus pumilus），于2011年04月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.4735；枯草芽孢杆菌SM16(Bacillus subtilis)于2009年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.3127。

2.权利要求1所述的一种防治棉花枯、黄萎病的生防复合菌剂BB1623的制备方法，其特征在于，

   1）将权利要求1所述的菌株CS23和SM16分别接种到LB培养液中30℃培养180 rpm振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；

2）当培养至OD值在0.5～0.8之间时，将种子菌液以1：100体积比加入装有发酵培养液的200 L发酵罐中，30℃ 250 rpm振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20%，通气量5～7 m³/小时，罐压 0.05～0.1KPa，然后6000 rpm离心10 min，每1000 ml培养液获得13～16 g湿菌，每克湿菌含3×10¹⁰～10¹⁵个菌体，取湿菌分别与菌体保藏液按1 g：40ml配成菌株CS23和SM16单菌菌剂，再将两种细菌单剂按照单菌活菌数量1:1配成混合制剂BB1623，合剂中活菌总浓度为1×10⁸～10¹²CFU/ml。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中LB培养液及发酵培养液配方如下：

1）LB培养液：氯化钠10 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, 酵母浸粉5 g/L，调节pH值为7.2，然后121℃灭菌20 min；

2）CS23发酵培养液：麦芽糖2.0 g/L, 玉米粉4 g/L,马铃薯粉4.5 g/L, 蛋白胨3 g/L, 二水氯化钙 0.2 g/L，一水硫酸锰 0.2 g/L, 磷酸氢二钾.2 g/L，调节pH值为7.0～7.2；

SM16发酵培养液：麦芽糖1.0 g/L, 玉米粉2.5 g/L,黄豆粉2.5 g/L, 蛋白胨3.5 g/L, 二水氯化钙 0.1 g/L，一水硫酸锰 0.1 g/L, 磷酸氢二钾0.15 g/L，调节pH值为7.2～7.4；

3）菌体保藏液：

a. 短小芽孢杆菌CS23菌体保藏液的制备：pH6.8，0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中加入Tween20至Tween20在缓冲液中的终浓度为0.02mol/L即得菌体保藏液；

b. 枯草芽孢杆菌SM16菌体保藏液的制备：pH7.0，0.15 mol/L的Tris缓冲液中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在缓冲液中的终浓度为0.01 mol/L即得菌体保藏液。

4.权利要求1～3之一所述的生防复合菌剂BB1623在防治棉花枯、黄萎病中的应用。