[发明专利]胆固醇酯酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种胆固醇酯酶，编码该胆固醇酯酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

背景技术

胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶。它是临床检测血清总胆固醇的重要酶之一。它能够快速准确的检测出血清中总胆固醇的浓度，以用来作为诊断诸如动脉硬化的脂质紊乱疾病，并且，可以用来研究其他诸多临床相关疾病如糖尿病、肾病等。酯化的胆固醇经酶水解后，经胆固醇氧化酶氧化，所产生的H₂O₂与4-氨基安替比林和苯酚反应生成醌亚胺。醌亚胺在505nm有特异吸收，反应产生的颜色强度与胆固醇含量成正比，因此可以用比色法测定胆固醇的量。

胆固醇酯酶不仅广泛存在于哺乳动物的胰腺、肝脏、肾上腺等组织中，而且也可以从微生物的发酵产物中提取获得，能产胆固醇酯酶的微生物，例如，假单胞菌(Pseudomonas sp.)、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)、镰孢菌(Fusarium sp.)、链霉菌(Streptomyces sp.)等。

但是目前的试剂盒所用的胆固醇酯酶存在着耐热性差的缺点，使试剂盒的运输、保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于胆固醇酯酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。此外，目前的试剂盒所用的胆固醇酯酶一般用产胆固醇酯酶的假单胞菌进行自然菌种发酵，产量较低，而且天然胆固醇酯酶耐热性差，在分离纯化过程中酶活损失严重。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有的胆固醇酯酶耐热性差的缺点，提供一种耐热性好、能在宽的温度范围内保持较高的稳定性和活性的胆固醇酯酶。

本发明的第二个目的是提供编码所述胆固醇酯酶的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。

本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供包括上述胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，利用随机突变的方法，从现有的委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 10712)胆固醇酯酶序列得到本发明具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的胆固醇酯酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得胆固醇酯酶具有很好的耐热性，能在宽的温度范围内保持较高的稳定性。

本发明提供了一种胆固醇酯酶，其中，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者

(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其胆固醇酯酶的功能不变的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明所述胆固醇酯酶的核苷酸序列。

本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。

本发明还提供了包括本发明所述的胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。

本发明提供的胆固醇酯酶具有耐热性好的优点。参见图3可知，本发明的胆固醇酯酶在65℃下于pH6.0的缓冲液中静置15分钟后仍具有60％的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的胆固醇酯酶的相对活性(不到20％)。

附图说明

图1实施例1的COE基因纯化的琼脂糖凝胶鉴定照片；

图2实施例1的COE诱导表达与纯化的SDS-PAGE鉴定照片；

图3制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶热稳定性对比图；

图4制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶pH稳定性曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种胆固醇酯酶，其中，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者