[发明专利]一种牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色方法

说明书

技术领域

本发明属于哺乳动物胚胎学领域，涉及一种差异染色方法，特别涉及一种牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色方法。

背景技术

囊胚中的内细胞团细胞数和滋养层细胞数及其二者的比值是衡量胚胎质量的标准之一。而体现囊胚中这两种细胞的染色称为差异染色。传统的差异染色方法的原理是依据内细胞团细胞在内，滋养层细胞在外，用红色的PI处理20s，染出外围的滋养层细胞，再用蓝色的Hoechst33342染出所有细胞，两种图片合并后，粉红色的外围细胞为滋养层细胞，蓝色的内层细胞为内细胞团细胞。

这种传统的囊胚差异染色方法由于是根据上述简单的里外位置原理，所以差异染色的准确率低，而且传统的差异染色还存在图片不清晰的问题。因此，如何寻找一种准确率高且图片清晰漂亮的囊胚差异染色方法已经成为当前胚胎学研究领域急需解决的问题。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色方法，提高差异染色的准确性，而且所获得的图片清晰漂亮。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色方法，包括以下步骤：

1)利用免疫染色方法，以抗CDX2单克隆抗体作为一抗，将其与特异表达在牛囊胚滋养层细胞的CDX2分子进行免疫结合：将牛囊胚在含一抗的免疫染色液中，于4℃孵育10～16h，然后进行清洗；

2)利用免疫染色方法，以红色荧光标记的能够与抗CDX2单克隆抗体结合的抗体作为二抗，对清洗后的结合有一抗的牛囊胚进行免疫染色：

在避光条件下，将牛囊胚在含二抗的免疫染色液中，于室温避光孵育2h，然后进行清洗；

3)在免疫染色完成后，对牛囊胚进行整体的细胞核荧光染色，以形成差异染色：将牛囊胚在细胞核荧光染色液中，于室温避光孵育3～5min，然后进行清洗；

4)将牛囊胚放在载玻片上，用盖玻片压好，然后用荧光显微镜照相。

所述的一抗为抗CDX2小鼠单克隆抗体，二抗为Alexa Fluor 555标记山羊抗小鼠IgG；用DAPI对牛囊胚进行整体的细胞核荧光染色。

所述的含一抗的免疫染色液是用免疫染色一抗稀释液将抗CDX2小鼠单克隆抗体稀释100～200倍；所述的含二抗的免疫染色液是用免疫荧光二抗稀释液将Alexa Fluor 555荧光标记山羊抗小鼠IgG避光稀释500倍。

所述的清洗是将牛囊胚在PBS-PVA溶液中吹洗多次，每次3～5min。

所述的牛囊胚在与一抗进行免疫染色时，还进行以下预处理：

1)将牛囊胚在PBS-PVA溶液中吹洗多次，每次3～5min；所述的PBS-PVA溶液为含有体积浓度为0.2％PVA的PBS溶液；

2)将牛囊胚转移到免疫染色固定液中固定，于室温孵育1～2h或4℃孵育过夜；

3)将固定后牛囊胚转移到含有体积浓度为0.2％Triton X-100的PBS溶液中透化，孵育30～45min；

4)将牛囊胚在PBS-PVA溶液中吹洗多次，每次3～5min；

5)将牛囊胚转移到免疫染色封闭液中封闭，于4℃孵育10～12h；再将牛囊胚在PBS-PVA溶液中吹洗多次，每次3～5min；完成预处理。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过寻找一种滋养层细胞特异表达蛋白，通过对该蛋白进行免疫染色来区分牛囊胚滋养层细胞和内细胞团细胞。CDX2蛋白在滋养层细胞内特异性表达，而在内细胞团细胞上不表达。

因此，用CDX2蛋白的特异性抗体染色牛囊胚，然后用发红色荧光的二抗结合一抗，故发红色荧光的细胞为CDX2蛋白表达的细胞，表示滋养层细胞；用DAPI染色牛囊胚所有细胞核，囊胚所有细胞都发蓝色荧光，表示囊胚总细胞。这样荧光染色叠合后，红色荧光叠合蓝色荧光后呈现粉红色，故粉红色的细胞为滋养层细胞，蓝色的细胞为内细胞团细胞。

与传统差异染色方法相比，基于CDX2染色的差异染色方法，没有假阳性，牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色的准确率为100％，而且图片清晰漂亮，有利于胚胎学的研究进展。

附图说明

图1为基于CDX2分子的红色免疫染色结果的显微照片；发红色荧光的细胞为滋养层细胞；

图2为DAPI染色牛囊胚所有细胞核的显微照片；细胞均呈现蓝色荧光，表示囊胚的细胞总数；