[发明专利]一种以大孔阴离子树脂为填充料的果糖基转移酶的初纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化技术领域，尤其是一种以大孔阴离子树脂为填充料的果糖基转移酶的初纯化方法。

背景技术

随着人们对保健食品和低热量食品需求的增加，自20世纪80年代以来出现了一系列所谓的替代甜味剂，包括异麦芽低聚糖、大豆低聚糖、帕拉金糖和低聚果糖在内的低聚糖是其中很重要的一类，其重要性在于它们具有难消化、低热量、降血脂、增殖双歧杆菌、抗龋齿及美容等独特的生理功能。

低聚果糖(Fructooligosaccharides，简称FOS)，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为：G-F-Fn，n＝1～3(G为葡萄糖，F为果糖)。低聚果糖是蔗糖分子的果糖残基上通β-2-1糖苷键连接1～3个果糖基而形成的果糖寡聚体：蔗果三糖(1-kestose，GF2)、蔗果四糖(nystose，GF3)、蔗果五糖(1^F-fructofuranosyl nystose，GF4)及其混合物。它一般是利用微生物或植物中具有果糖转移活性的酶作用于蔗糖而得的。

目前低聚果糖的工业生产主要是通过发酵产生的果糖基转移酶(fructosyltransferase)催化而得到的。由于发酵得到的果糖基转移酶经过破壁后的酶液含有较多的其它成分，影响果糖基转移酶的催化活性和稳定性，因而果糖基转移酶的纯化具有重要的现实和实践意义，杨光礼研究员(2002年)和魏远安教授(2008年)报告的果糖基转移酶的纯化都是用葡聚糖等实验性填充料，生产成本高，工业生产推广较困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种以大孔阴离子树脂为填充料来进行果糖基转移酶的初步分离的方法。本方法过程简单，所得到的初步纯化的果糖基转移酶具有生产成本低，酶活回收率高，去除的杂蛋白较多，具有广泛的工业用途。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种以大孔阴离子树脂为填充料的果糖基转移酶的初纯化方法，其特征在于：将经预处理大孔阴离子树脂装层析柱，用20mmol/mL的pH值为6.5磷酸缓冲液以2.0mL/min的流速通过层析柱，平衡层析柱，将含有果糖基转移酶的粗酶液上样，用两倍体积的磷酸缓冲液洗脱，再用两倍体积的磷酸缓冲液配置的1mol/mL的NaCl溶液0-1mol/mL梯度洗脱，用UV280nm在线监测，收集有酶活的峰，将收集到有酶活的酶液浓缩即得果糖基转移酶。

而且，所述大孔阴离子树脂为大孔阴离子树脂D290。

而且，所述预处理大孔阴离子树脂的方法为：大孔阴离子树脂先用蒸馏水浸泡4h溶胀，除杂，然后用0.1mol/L的盐酸浸泡2h，去离子水冲洗至中性；再用0.1mol/L的氢氧化钠浸泡2h，用去离子水冲洗至中性，用2倍体积的去离子水浸泡，放置于4℃保存备用。

而且，所述果糖基转移酶的粗酶液的制备方法如下：

将经过发酵培养的菌丝体，离心洗净，收集菌丝体，将菌丝溶于5倍体积的水，球磨机5000r/min条件下20min，球磨两次，然后在超高压均质机1000Pa破壁两次，冷冻离心，超滤浓缩得到粗酶液。

而且，所用NaCl溶液梯度为0-1mol/mL。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明利用大孔阴离子树脂D290作为填充料分离纯化果糖基转移酶，树脂与果糖基转移酶之间特异吸附，有效去除的杂蛋白，果糖基转移酶被停留在层析柱内，经过洗脱液洗脱后获得纯化后的果糖基转移酶，本方法具有生产成本低，使用方便，效率高，酶活回收率高的特点，其具有广泛的应用前景。

2、本方法纯化过程简单，所得到的初步纯化的果糖基转移酶具有生产成本低，酶活回收率高，去除的杂蛋白较多，具有广泛的工业用途。

3、本发明还提供了一种游离果糖基转移酶的制备方法，先球磨机5000r/min条件下20min，球磨两次，然后在超高压均质机1000Pa破壁两次，胞内酶溶出率高，回收率高。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

以下实施例总中果糖基转移酶来自黑曲霉发酵获得，本方法同样适合其他方法或者渠道得到的含有果糖基转移酶的溶液、粗酶液或发酵液等的纯化，方法原理通本方法，不再一一举例。

实施例1

一种以大孔阴离子树脂为填充料的果糖基转移酶的初纯化方法，步骤如下：