[发明专利]一种β-半乳糖苷酶的突变体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法，当活性中心位点附近氨基酸发生突变后，得到活性提高的β-半乳糖苷酶，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

低聚半乳糖（GOs）是一种新型功能性低聚糖，目前已应用于婴儿食品、烘焙食品、饮料等行业中。据统计，日本目前低聚半乳糖的年产量达6500～7000吨，仅低于低聚异麦芽糖，但年销售额为所有功能性低聚糖之首。在欧美，人们对低聚半乳糖的需求量也日益增长。在我国，低聚半乳糖还是一个新兴行业，尚未形成较大规模。在“九五”以后，在山东禹城，广东江门等地才陆续开始了低聚半乳糖的生产，但产量有限。 

β-半乳糖苷酶是工业酶法生产低聚半乳糖的主要用酶。β-半乳糖苷酶作用于乳糖的β(1→4)糖苷键，形成半乳糖基-酶复合物，在该酶的转苷活力作用下，复合物进一步与半乳糖、二糖或三糖结合，生成低聚半乳糖。不同微生物来源的β-半乳糖苷酶由于本身性质不同，合成的GOs能力也存在差异，如来源于E. coli、A. niger的β-半乳糖苷酶的水解活性较强，而来源于B. circulans、A. oryzae、Kluyveromyces lactis的β-半乳糖苷酶则有较强的转苷活性。目前，国内对β-半乳糖苷酶研究很多，但多为其水解方面的研究，在转苷活性方面研究相对不足，，且工业化推广少，限制了低聚半乳糖产能的提高。 

本发明所使用的来源于 Sulfolobus solfataricus P2的β-半乳糖苷酶虽然在转化过程中能够实现低聚半乳糖的高效生产，但是后提取工艺仍不可缺少。如何提高底物转化率，节约成本，简化后提取工艺将成为β-半乳糖苷酶的研究方向。 

发明内容

本发明提供了一种β-半乳糖苷酶突变体，该突变体是将硫矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus ）的β-半乳糖苷酶（NCBI编号：AAK43121）活性中心附近氨基酸的取代，与其亲代β-半乳糖苷酶相比，其对乳糖具有更高的转化率。 

所述β-半乳糖苷酶突变体是441位氨基酸苯丙氨酸突变为酪氨酸，命名为F441Y。 

本发明应用于低聚半乳糖的生产，最适温度为70℃，最适pH为6.5。 

本发明在构建的突变株的基础上优化了突变体酶的酶转化条件，实现了低聚半乳糖产量的提高，具有较高的工业价值。使用本突变体生产低聚半乳糖，在最优酶转化条件下，突变体酶F441Y生产的低聚半乳糖的产率达到61%，较野生酶高10%左右。 

附图说明

图1利用野生酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适温度; 

图2利用突变酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适温度;

图3利用野生酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适Ph;

图4利用突变酶转化乳糖生成低聚半乳糖的最适pH。

具体实施方式

实施例1：本例说明野生β-半乳糖苷酶的制备。

、β-半乳糖苷酶的克隆

培养硫矿硫化叶菌P2（购自ATCC，ATCC编号：35095），并提取其总DNA。

根据硫矿硫化叶菌的β-糖苷酶的基因lacS基因(NCBI编号：AE006641)设计引物： 

正向引物P1： GTCTGCATATGTACTCATTTCCAAATAGC(下划线为酶切位点)

反向引物P2： GAATCTCGAGTTAGTGCCTTAATGGCTTTAC(下划线为酶切位点)

利用上述引物，以硫矿硫化叶菌P2的总DNA为模板，PCR扩增β-半乳糖苷酶基因，反应在50μL体系中进行。反应条件为： 94℃ 预变性4 min；随后进行30个循环(94℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 1min50s)； 72℃延伸10 min；最后4℃ 保温。扩增得到的PCR片段，经胶回收后，与pMD18- T simple载体连接，并将连接产物转化至大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑5个菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒并测序，结果正确。

、β-半乳糖苷酶的表达与制备：