[发明专利]一种肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素和硫酸皮肤素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备软骨素酶B和软骨素酶AC的方法。

背景技术

软骨素(CS)是糖胺聚糖的一类，由已糖醛酸-乙酰化半乳糖胺重复组成长链骨架。依糖链硫酸化程度可分成7小类：未硫酸化软骨素(无硫酸基)、多硫酸软骨素(完全硫酸化)、硫酸软骨素A-E，后5种在硫酸化位点和硫酸化程度上各有不同。其中软骨素A、B、C是最常见的3种，而软骨素B又被称作硫酸皮肤素(DS)。这些软骨素类可能参与调节多种生理环节如细胞分化、细胞结合、激素作用等。

软骨素酶是一类能特异性降解软骨素多糖链的酶，可以由此探索软骨素在胞内的生理作用并研究开发用于临床治疗的药物。软骨素酶最早的研究大概起自1957年，Korn等从肝素黄杆菌(Flavobac terium heparinum)中分离出可降解硫酸软骨素的活性部分。

1975年，日本学者Manabu等从自然生境中筛选出253种产软骨素酶的细菌，分别归属于七个属：Aeromonas(气单胞菌属)，Vibrio(弧菌属)，Flavobacterium(黄杆菌属)，Beneckea，Proteus，Micrococcus(微球菌属)，Arthrobacter(节杆菌属)。发现其中一种气单胞菌产软骨素酶AC的能力远高于肝素黄杆菌，纯化后比活为99.7U/mg。

Takegawa等(1991)报道了一种分离自金色细菌的可降解CS A、C的酶，分子量约82000，铜离子是其抑制剂。

Linn等(1985)报道两种可降解CS A、C的酶，分离自Bacteroides thetaiotaomicron，分子量分别为104000和108000。

加拿大IBEX公司是近些年研究、开发、销售肝素黄杆菌软骨素酶的主要机构。

1995年IBEX的一篇文章中披露一种纯化工艺：通过鱼精蛋白沉淀、QAE柱层析、HA-HPLC、Ge1-HPLC等步骤纯化出软骨素AC酶，可降解软骨素A、C，分子量77000，比活68-111U/mg，纯化倍数1900-3700倍；通过阳离子交换层析、硫酸纤维素柱层析、HA柱层析、强阳离子交换柱层析、凝胶过滤层析等步骤纯化出软骨素B酶，可降解软骨素B，分子量55000，比活278U/mg，纯化倍数471倍。

在2000年的一篇专利中，IBEX将前一种纯化工艺做修改，采用细胞破碎、阳离子交换层析、亲和层析、HA柱层析、高效离子交换柱层析和凝胶过滤层析等一套步骤纯化出两种软骨素酶，软骨素AC酶比活提高到211.4U/mg，软骨素B酶比活278.7U/mg。

本发明给出一种同时制备纯化出软骨素酶B和软骨素酶AC的方法，在氯化钙保护之下、并含肝素和硫酸皮肤素缓冲液洗脱的多步层析分离技术，最终制备软骨素AC酶比活提高到220.8U/mg，软骨素B酶比活为724.2U/mg，均高于已有报道。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法，该方法可同时纯化出2种酶，制备的软骨素AC酶比活提高到220.8U/mg，软骨素B酶比活为724.2U/mg，。与已报道方法相比，软骨素B酶比活增加近两倍，软骨素AC酶比活也高于最高报道。

本发明包括下述顺序的步骤：

(1)肝素黄杆菌的发酵：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天。然后按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天。菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时(150W，5s，5s)。4℃，10000rpm，离心30min，上清即为粗酶液。

(2)粗酶液的硫酸铵沉淀法粗纯化：

向粗酶液中加硫酸铵至45％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，向上清继续加硫酸铵至65％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，取沉淀溶于含硫酸铵45％饱和度的Tris-HCl^①缓冲液；得粗纯化液。

(3)粗纯化液的OCTYL柱分离：