[发明专利]一种肝素黄杆菌软骨素酶B和软骨素酶AC的制备方法

权利要求书

1.一种肝素黄杆菌软骨素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤：

(1)肝素黄杆菌的发酵：

将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23℃，150rpm，培养1天。然后按5％接种量接入发酵培养基，23℃，150rpm，培养2-3天。菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时，4℃，10000rpm，离心30min，上清即为粗酶液；

(2)粗酶液的硫酸铵沉淀法粗纯化：

向粗酶液中加硫酸铵至45％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，向上清继续加硫酸铵至65％饱和度，4℃沉淀1小时，10000rpm，离心30min，取沉淀溶于含硫酸铵45％饱和度的Tris-HCl①缓冲液；得粗纯化液；

(3)粗纯化液的OCTYL柱分离：

将步骤(2)所得粗纯化液上一根用含硫酸铵45％饱和度的Tris-HCl①缓冲液平衡过的OCTYL柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中含硫酸铵线形梯度45％-0饱和度，分别收集洗脱液中具有软骨素酶B活性和软骨素酶AC活性的洗脱液，该两个洗脱液呈两个活性峰I、II；

(4)软骨素酶B的纯化：

步骤(3)活性峰I的洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶B活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl^①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶B；

(5)软骨素酶AC的纯化：

活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl^①缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有软骨素酶AC活性的组分，透析后上一根用Tris-HCl^④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl^④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HCl^②缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0.5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量10kd的超滤离心管浓缩，得到软骨素酶AC。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a中所述种子培养基的组成为牛肉膏0.5％、蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl为0.5％、pH7.0。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述发酵培养基组成为硫酸皮肤素8，K₂HPO₄ 2.5，NaH₂PO₄ 2.5，NH₄Cl 2.0，MgCl₂ 0.5，组氨酸0.5，甲硫氨酸0.5，微量元素NaMoO₃、CuCl₂、FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、CaCl₂各1×10^-4M，单位为g/L。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl^①缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl^②缓冲液含10mM CaCl₂、pH6.5-8.0。