[发明专利]猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)是引起仔猪腹泻的主要肠道病毒，二者均属冠状病毒科、冠状病毒属的病毒，单链正股RNA病毒，都能造成肠绒毛的萎缩或变短，均有类似的传染途径和临床症状，感染猪均表现为水样腹泻、呕吐、脱水及新生仔猪的高死亡率。在全世界范围内广泛发生。由于传染性胃肠炎和流行性腹泻的临床表现、病理变化、流行病学等方面都非常相似，但两病原没有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此给这两种病的诊治和预防带来了一定困难。诊断这两种疾病的传统方法有病毒分离、电镜检测、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。虽说上述方法能够鉴别诊断这两种病，但由于实验方法的限制，导致检测耗时过长，无法在病毒感染初期进行诊断。近年来，随着分子生物学的发展，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)在PEDV和TGEV检测方面的应用越来越广泛，与传统的方法相比较，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便，但步骤繁杂、假阳性较多、缺乏准确定量、灵敏度不够高等妨碍了RT-PCR在实际临床中的应用。1995年美Perkin Elmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术，从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外，使PCR技术得到更新和发展，从而广泛地应用于临床以及其它相关核酸的研究。

本发明首次将荧光RT-PCR技术应用于同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测领域，提供了针对猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的特异性引物、探针序列、试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核苷酸序列，包括引物和探针。

本发明要解决的第二个技术问题是提供快速、准确、使用方便的检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的引物和探针，具体如下：

通过序列比较，根据猪传染性胃肠炎病毒TGEV Miller M6株N基因的序列（GenBank：DQ811785），在其保守区27832-27938位置设计一对引物及一条探针：

1）TGEV正义引物（TGEV-F） 5'ACAATTCCTTCAGCAGATTAATGC3' （SEQ ID NO：1）；

2）TGEV反义引物（TGEV-R）5'CCTCTTGCTCTGACCTTTCTG3' （SEQ ID NO：2）；

3）TGEV探针（TGEV-probe）5'(JOE) ATGCTCGYCCATCAGAAGTGGCAAA (TAMARA) 3'（SEQ ID NO：3），该探针的5’端标记报告荧光基团JOE，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA；

其中，Y代表兼并碱基T或C；扩增目的片段为107bp。

通过序列比较，根据猪流行性腹泻病毒PEDV CV777株N基因的序列(GenBank：AF353511)，在其保守区27163-27348位置设计一对引物及一条探针：

4）PEDV正义引物（PEDV-F）5’AACAAATCCAGGGCCACTT3’ （SEQ ID NO：4）；

5）PEDV反义引物（PEDV-R）5’TAAACTGGCGATCTGAGCA3’ （SEQ ID NO：5）；                       

6）PEDV 探针（PEDV-probe）

5’ (FAM) TCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAAT (TAMARA) 3’ （SEQ ID NO：6），该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA ；

扩增目的基因大小为186bp。

本发明还提供了一种猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒，由以下组分组成：