[发明专利]固相多肽合成生长抑素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生长抑素的生产方法，尤其涉及固相多肽合成生长抑素的新生产工艺。

背景技术

中文名：生长抑素。其他名称：生长抑素释放抑制激素，商品名：施他宁。英文名：Somatostatin，Stilamin。

结构式：

分子式及分子量：C₇₆H₁₀₄N₁₈O₁₉S₂，1637.9。

临床用途：严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。

申请号02155189.8的专利“生长抑素全合成新方法”公开了固相多肽合成方法，该方法用DCC为缩合剂合成了12肽，再接上Boc-Ala-Gly-OH二肽，最后DMSO氧化，中压色谱柱层析纯化的方法。该专利所存在的显著缺陷是：(1)用DCC缩合反应时间长，生产周期太长，(2)制备二肽操作比较麻烦，(3)DMSO氧化三废较多，(4)中压色谱柱层析纯化速度较慢、精度较差。

申请号200910131201.4的专利“十四肽生长抑素的制备方法”公开了一种液相片段合成的方法，用液相法分别合成了5肽、3肽和6肽，然后将3个片段分别用液相法合成依次缩合而成。此法不足之处在于：(1)制备五肽、三肽和六肽的操作比较麻烦，反应周期也很长，(2)未进行分离纯化。

申请号2009101424202的专利“一种生长抑素的合成方法”公开了一种液相片段合成的方法，将4个4肽片段分别用液相法合成，再用将4个4肽片段依次缩合而成。此法不足之处在于：(1)制备4个四肽的操作比较麻烦，反应周期很长。(2)空气氧化反应需2-3天，不适用于工业化生产，(3)分离纯化用0.1％TFA专一性较差。

因此目前的方法限制了生长抑素的大规模生产和使用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成生长抑素的新生产工艺，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法包括如下步骤：

以2-氯三苯基醇树脂(2-Chlorotritylalcohol Resin，2-CTA Resin)为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型十四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型生长抑素，并在pH为7～9的条件下用双氧水氧化，获得生长抑素粗品，再经C18高效液相柱进行分离纯化，再经冷冻干燥后，制得生长抑素精品。

按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的工艺包括如下步骤：

(1)生产Fmoc-Cys(Trt)-树脂

将2-氯三苯基醇树脂(100-150目，0.7mmol/g)，加入DCM，室温搅拌溶胀0.5～1小时，搅拌下，加入氯化亚砜，再于室温搅拌反应2～3小时，抽干，用DCM洗涤，抽干；

2-氯三苯基醇树脂与氯化亚砜的重量比为：1∶1～2；

加入DMF，再加入用DMF溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，于32～38℃反应1.0～1.5小时，再加甲醇，32～37℃反应30～90分钟，抽干，树脂用甲醇洗涤一次，用DMF洗洗，抽干；

DMF中，Fmoc-Cys(Trt)-OH∶2-氯三苯基醇树脂＝1～2∶1，摩尔比；

DIPEA∶2-氯三苯基醇树脂＝5～7∶1，摩尔比；

(2)生产Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，32～35℃脱帽反应22～24分钟，抽干，用DMF洗涤，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，32-37℃缩合反应1.0～1.5小时，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

各个组分的用量，以2-氯三苯基醇树脂为基准，为：

重量浓度为25.5～26.5％的PIP∶2-氯三苯基醇树脂＝6～8∶1，重量；

Fmoc-Ser(tBu)-OH∶2-氯三苯基醇树脂＝3～4∶1，摩尔；