[发明专利]固相多肽合成生长抑素的方法

权利要求书

1.固相多肽合成生长抑素的方法，其特征在于，包括如下步骤：以2-氯三苯基醇树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型十四肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型生长抑素，并在pH为7～9的条件下用双氧水氧化，获得生长抑素粗品，再经C18高效液相柱进行分离纯化，再经冷冻干燥后，制得生长抑素精品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十四肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法，包括如下步骤：

(1)生产Fmoc-Cys(Trt)-树脂

将2-氯三苯基醇树脂，加入DCM，室温搅拌溶胀，加入氯化亚砜，再于室温反应2～3小时，抽干，用DCM洗涤，抽干；

2-氯三苯基醇树脂与氯化亚砜的重量比为：1∶1～2；

加入DMF，再加入用DMF溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，于32～38℃反应1.0～1.5小时，再加甲醇，32～37℃反应30～90分钟，抽干，树脂用甲醇洗涤一次，用DMF洗洗，抽干；

DMF中，Fmoc-Cys(Trt)-OH∶2-氯三苯基醇树脂＝1～2∶1，摩尔比；

DIPEA∶2-氯三苯基醇树脂＝5～7∶1，摩尔比；

(2)生产Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(1)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(3)生产Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(2)的Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽，抽干，分别用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(4)生产Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤二次，抽干，获得Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(5)生产Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(4)的Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，用甲醇洗涤一次，用DMF洗五次，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(6)生产Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(5)的Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF 7L溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(7)生产Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(6)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(8)生产Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(7)的Fmoc-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(9)生产Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(8)的Fmoc-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(10)生产Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(9)的Fmoc-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(11)生产Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(10)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(12)生产Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(11)的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(13)生产Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(12)的Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂；

(14)生产Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂

在步骤(13)的Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂中，加入重量浓度为25.5～26.5％PIP的DMF溶液，脱帽反应，抽干，依次用甲醇和DMF洗涤，抽干；

加入用DMF溶解的Boc-Ala-OH、TBTU、HOBT和NMM的混合物，缩合反应，抽干，用DMF洗涤，抽干，获得Boc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-树脂，约得保护的十四肽树脂；