[发明专利]一种制备饲养层细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备饲养层细胞的方法。

背景技术

饲养层细胞是用特定的细胞(如皮肤成纤维细胞、输卵管上皮细胞等)经射线照射或丝裂霉素-C等阻断有丝分裂处理后制备的单层细胞，饲养层细胞能分泌成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等促有丝分裂因子，促进胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)的增殖，同时也能分泌白血病抑制因子(Leukemia inhibitory{actor，LIF)等细胞分化抑制因子，抑制ES细胞的分化。

ES细胞是从胚胎内细胞团或原始生殖嵴中分离，经体外抑制分化培养获得的一种高度未分化的具有多发育潜能性的细胞系。ES细胞对体外培养条件要求极为严格，饲养层的质量好坏直接关系到ES细胞的分离成功与否。小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性，故而常用于ES细胞的体外分离培养，是各实验室开展干细胞研究的前提，是干细胞研究不可缺少的环节。目前小鼠胚胎成纤维细胞fmouse embryonic fibroblast，MEF)制备饲养层主要使用的方法有γ射线照射或者使用丝裂霉素C处理。γ射线的优点是可大批处理MEF细胞，但是一些小的实验室不具备实验条件。因此多数实验研究均采用丝裂霉素C处理MEF来制备饲养层。但是，目前分离培养饲养层细胞的方法大多数属于经验性，制备过程繁琐，工作量大，细胞处理的方法、条件尚无确切的规程和报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备饲养层细胞的方法。

本发明提供的制备饲养层细胞的方法，包括如下步骤：

(1)将离体的成纤维细胞用10μg/ml丝裂霉素C处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；

(2)将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，收集贴壁细胞；

在所述步骤(1)和所述步骤(2)之间还包括0至2次的如下步骤：将离体的成纤维细胞用前一步骤收集的培养液上清处理，分别收集培养液上清和贴壁细胞；

以上每一步骤得到的贴壁细胞均为饲养层细胞。

所述步骤(1)中，所述成纤维细胞(离体的)具体可在含10μg/ml丝裂霉素C的完全培养基中进行所述处理。所述完全培养基可为任何市售的用于细胞培养的完全培养基，具体可由DMEM培养基和如下溶质组成：10％(体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。

所述步骤(1)，和/或所述步骤(2)，和/或所述步骤(1)和所述步骤(2)之间的步骤中，所述处理的条件具体可为37℃、5％CO₂培养箱中培养2.5h。

在进行所述方法前，所述成纤维细胞可先进行传代；用传代后的成纤维细胞(离体的)进行所述步骤(1)，和/或所述步骤(2)，和/或所述步骤(1)和所述步骤(2)之间的步骤。

所述传代的方法具体如下：将所述成纤维细胞(离体的)进行消化后培育2-4天(如2-3天)，然后进行(1∶3)-(1∶5)传代。所述传代的次数具体可为2-5次(如3-5次)，优选为3次。

所述成纤维细胞(离体的)进行所述消化后培育2-4天后达到的细胞密度具体可为80-90％。

所述方法还可包括将所述贴壁细胞进行消化的步骤。

所述方法优选包括如下步骤：将每一步骤得到的所述贴壁细胞消化后立即于4℃放置30分钟，然后置于-80℃。进行所述4℃放置之前，所述贴壁细胞具体可用完全培养基重悬并与4℃预冷的2×冻存液等体积混合。所述完全培养基具体可由DMEM培养基和如下溶质组成：10％(体积比)FBS，2mmol/L glutamine。所述2×冻存液具体可由DMEM培养基和如下溶质组成：10％(体积比)DMSO，10％(体积比)FBS，2mmol/Lglutamine。

所述成纤维细胞(离体的)具体可为小鼠胚胎成纤维细胞(离体的)。所述饲养层细胞具体可为用于培养胚胎干细胞的饲养层细胞

以上任一所述方法得到的饲养层细胞也属于本发明的保护范围。

所述饲养层细胞可用于培养胚胎干细胞，如人胚胎干细胞。

本发明提供一种较为简捷易掌握的饲养层制备方法，为培养ESC、iPS细胞并开展相关研究奠定了基础。利用该方法制备成纤维细胞饲养层，既简化了实验操作，又节省了实验费用。