[发明专利]一种大豆水溶性蛋白检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种大豆水溶性蛋白检测方法。

背景技术

大豆中所含的蛋白质含量约为38％，是谷类食物的4～5倍，其氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，除蛋氨酸略低外，其余必需氨基酸含量均较丰富。在营养价值上，大豆蛋白质可与动物蛋白等同。大豆蛋白饮品中的精氨酸含量比牛奶高，其精氨酸与赖氨酸之比例也较合理，脂质、亚油酸含量极为丰富且不含胆固醇，可防止成年期心血管疾病发生。此外，大豆还含有丰富的卵磷脂，可以清除血液中多余的固醇类。

近年来，随着人民生活水平的提高，大豆蛋白，特别是大豆水溶性蛋白，因其极易被人体直接吸收，且与人体内蛋白质的组成和结构相似，不但其营养品质得到了越来越高的重视，而且它的生理保健功能亦被逐步发现，如何提高大豆水溶性蛋白含量也成了栽培、育种和遗传研究的一个重要方向。因此，大豆水溶性蛋白含量成为检测大豆品质的重要指标，对大豆品种进行水溶性蛋白含量的分析具有重要指导意义。

1988年，我国第一次根据水溶性蛋白含量对大豆进行分级，2006年农业部专门制定了大豆水溶性蛋白含量的测定的国家标准。国际标准中大豆水溶性蛋白的检测方式是凯氏定氮法，该方法适用于所有蛋白的标准检验，然而凯氏定氮法需用样品用量大，单籽粒大豆在不影响其萌发率的前提下，所能提供的样品水溶性蛋白含量很小，接近凯氏定氮法的检测下限，误差影响较大。因此该方法只适于样品量较大的高世代材料的检测，而对于大豆育种工作者前期基础材料的筛选很不适合，且该方法操作危险、步骤繁琐，耗时过长，不适合大批量检测。染料结合法是利用蛋白与染料结合后吸光度的改变来检测蛋白含量，有人利用偶氮洋红G染料快速测定大豆水溶性蛋白，但该研究还处在条件摸索阶段，未应用到大批量的标准检验中。考马斯亮蓝法发明于1976年，也属于染料结合法的一种，初时仅用于定性检验，后随着分光光度计检测精度的提高，也应用于乳品、中药中蛋白质的检测，以及生理病理学中蛋白质成分的鉴定，但在作物中还未见使用。考马斯亮蓝法具有简单、快速、灵敏的特点，但光电信号不稳定、线性拟合度，限制了其检测准确度。

低世代材料种子量少，样品宝贵，还需要继续向下遗传从而获得高世代材料，因而检测和繁育同样重要，这就要求在检测的同时，保证种子的生命活性，所以提供一种适用于低世代大豆水溶性蛋白的检测方法，具有现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种大豆水溶性蛋白检测方法。该方法通过改进大豆取样方式，既满足低世代大豆中水溶性蛋白的检测，又不影响剩余部分的正常育苗，使低世代筛选与高世代遗传分析得以实现。本发明还通过缩小反应体系，改变蛋白样品与考马斯亮兰染料之间的比例，提高了检测方法的线性拟合度，适用于样品量较少的样本检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种大豆水溶性蛋白检测方法，包括：

步骤1：沿与大豆种脐平行的方向，于种脐背侧按照大豆质量的1/11～1/7取样，浸提后获得待测液；

步骤2：取所述待测液与浓度为0.1mg/mL的考马斯亮蓝染液按照体积比为30～35∶2000的比例混合，混匀后在595nm下检测样品吸光度值；制作标准曲线，利用比色法得到所述待测液中水溶性蛋白含量。

本发明通过等比例缩减反应体系中待测液和考马斯亮蓝染液的量，发现较小的反应体系中，标准曲线的线性关系更好。因为分光光度计检测最少需要2mL，所以选择考马斯亮蓝染料用量定为2mL。

在确定了考马斯亮蓝染料用量定为2mL的基础上，本发明对反应体系中待测液和考马斯亮蓝染液的量进行非等比例缩减，发现水溶性蛋白含量在过低浓度或过高浓度时，检测结果均会出现显色不敏感。其中，20μL/2mL、25μL/2mL、30μL/2mL的200μg/mL位置以及45μL/2mL、50μL/2mL的1000μg/mL位置，均出现程度不等的非线性偏移。30～35μL/2mL的反应体系，线性关系最好。因此，本发明提供的检测方法中，待测液和考马斯亮蓝染液的体积比选择30～35μL∶2mL。