[发明专利]多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于多基因突变位点的实时检测技术领域，具体涉及一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法。

背景技术

DNA突变(mutation)是遗传物质中任何可检测的能遗传的改变，但不包括遗传重组。突变是可以传递给子细胞，甚至延续给后代，从而导致产生了突变细胞或个体。对于一个多细胞生物来说，如果突变仅发生在体细胞中，那么这种突变是不会传递给后代的。这种类型的突变称为体细胞突变。但若突变发生在的生殖细胞中，那么这种突变就能通过配子传递给下一代，在后代个体的体细胞和生殖细胞中产生同样的突变，这种突变就叫做种系突变。由于遗传物质一般是DNA，突变会影响到DNA的化学或物理的构成，它的复制，表型功能或者一个或多个碱基对序列会发生改变，例如增加、减少或置换碱基，颠倒顺序或转移到新的位置上。发生在基因水平的突变称为基因突变，它涉及到基因的一个或多个序列的改变。包括一对或多对碱基对的替换，增加或缺失。由于DNA碱基对的改变引起的基因突变称为点突变。每一个人或动物个体都携带有其独特的突变谱，包括长短不一的增加或缺失(indel)、DNA片断包括基因重复数(CNV)和点突变(SNP)。

突变的种类包括：

(1)碱基替换突变

①同义突变：由于密码子具有兼并性，因此，单个碱基置换后使mRNA上改变后的密码子与改变前所编码的氨基酸一样，肽链中出现同一氨基酸。

②错义突变：DNA分子中的核苷酸置换后改变了mRNA上的遗传密码，从而导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代，称为错义突变。错义突变的结果是产生异常蛋白质。

③无义突变：当单个碱基置换导致出现终止密码子(UAG、UAA、UGA)时，多肽链将提前终止合成，所产生的蛋白质大都失去活性或丧失正常功能，这种突变称为无义突变。

④终止密码突变：当DNA分子中一个终止密码发生突变，成为编码氨基酸的密码子时，多肽链的合成将继续进行，肽链延长直到遇到下一个终止密码子时才停止，因而形成了延长的异常肽链，这种突变称为终止密码突变。

(2)移码突变

基因内部DNA的碱基序列中，丢失或插入1个或几个碱基对，从而使碱基对的排列顺序发生改变引起突变。

基因片段上碱基数单个增添或减少一定会导致生物性状的改变。若碱基对数以3的倍数增添或减少，则合成的蛋白质上氨基酸种类排列顺序变化较小。

基因片段上可能某一位点上添(减)1个碱基对，然后在以后某一位点上又减(添)4个碱基对，使其添减之差为3或3的倍数，则合成的蛋白质氨基酸种类在这两个位点之间变化，其他部位变化不明显。

(3)抑制突变：RNA上的反密码子通过碱基互补配对能识别mRNA上的密码子，从而将mRNA上的核苷酸序列转变为多肽链上的序列。如果控制mRNA上的基因所在的DNA分子上某一对脱氧核苷酸发生改变，产生了基因突变，但这种突变刚好被tRNA的基因突变所纠正，结果是突变基因的最终产物并未发生改变。由于tRNA基因的突变，在翻译过程中抑制了mRNA上的突变基因的表达，故称为抑制突变。

(4)重组突变：基因所在的DNA分子断裂后，不同的DNA分子在断裂处可能发生交换重组，极性相同的不同单链重新连接起来，产生新组合的DNA分子的脱氧核苷酸序列，不同于原来的DNA分子序列，从而可以导致各种各样的突变。

检测突变的技术方法：

1、核酸分子杂交技术，用于检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。常用有以下方法。

(1)限制性内切酶分析法。此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析。

(2)等位基因特异寡核苷酸探针杂交法。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸；二是相应于正常基因碱基序的寡核苷酸，用它们分别与受检DNA进行分子杂交。从而检测受检者基因是否发生突变，以及是否有新的突变类型。

2、聚合酶链反应(PCR)

PCR技术采用特异的引物，能特异地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧的碱基序列和正常基因仍然相同。因此。根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片断扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。