[发明专利]多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片及其检测方法

权利要求书

1.一种多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述基因检测芯片包括多孔PCR板，所述多孔PCR板的孔内设置有PCR反应体系，所述PCR反应体系包括用于特异性扩增目标基因靶向序列的若干个引物对、荧光探针，所述引物对含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列；所述荧光探针在PCR扩增时荧光探针的荧光分子发射荧光信号。

2.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述目标基因选自肌营养不良蛋白基因（dystrophin）。

3.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述引物为SEQ ID No：37～208序列之一的正向引物或反向引物；所述荧光探针具有SEQ ID No：209～294之一的连续核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述PCR反应体系还包括PCR缓冲液、dNTPs、Gold Taq酶，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～5 ×；dNTPs 0.01～1.5mM；引物 终浓度为0.01～2μM；Gold Taq DNA聚合酶    0.01～1.0U/μL；MgCl₂    终浓度为2～3mM；荧光探针    1～3×。

5.根据权利要求4所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～5 ×；dNTPs 0. 1～0.5mM；引物 终浓度为0.1～0.5μM；Gold Taq DNA聚合酶    0.01～1.0U/μL；MgCl₂    终浓度为2～3mM；荧光探针    1～2×。

6.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述荧光探针选自Taqman探针；所述PCR缓冲液包括 Tris﹒cl，氯化钾，硫酸铵， 氯化镁； -20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.根据权利要求1所述的多基因突变位点的实时PCR基因检测芯片，其特征在于所述多孔PCR板为96孔PCR板或384孔PCR板；每个PCR板的孔内设置不同的引物和荧光探针，且多孔PCR板每个孔的PCR反应条件相同。

8.一种实时检测目标基因外显子多位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）设计并选取包括含有目标基因外显子中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物和荧光探针对分别置于多孔PCR板的不同孔内形成基因检测芯片；

（2）提取模板DNA，将模板DNA加入基因检测芯片多孔PCR板的每个孔内对模板DNA中目标基因进行PCR扩增；

（3）根据qPCR检测对扩增后的目标基因的基因突变位点。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的浓度在50～100ng/μL。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中进行PCR反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，56～60℃退火10～30s，70～75℃延伸15～30s，扩增35～50个循环。